Strukturelle Basis von HIV | Changchun O-Ringe-Gruppe

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1237 (2023) Diesen Artikel zitieren

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HIV-1-Reifungsinhibitoren (MIs), Bevirimat (BVM) und seine Analoga stören die katalytische Abspaltung des Spacerpeptids 1 (SP1) von der C-terminalen Domäne des Kapsidproteins (CACTD), indem sie an die CACTD-SP1-Region binden und diese stabilisieren . MIs werden derzeit als alternative Medikamente zur Ergänzung aktueller antiretroviraler Therapien entwickelt. Obwohl sie vielversprechend sind, sind ihr Wirkmechanismus und die damit verbundenen Virusresistenzwege auf molekularer, biochemischer und struktureller Ebene noch unzureichend verstanden. Wir berichten über atomar aufgelöste Magic-Winkel-Spin-NMR-Strukturen von mikrokristallinen Anordnungen von CACTD-SP1, komplexiert mit BVM und/oder dem Anordnungskofaktor Inositolhexakisphosphat (IP6). Unsere Ergebnisse zeigen einen Mechanismus, durch den BVM die Reifung stört, die Pore des 6-Helix-Bündels verengt und die Bewegungen von SP1 und dem gleichzeitig gebundenen IP6 unterdrückt. Darüber hinaus weisen BVM-resistente SP1-A1V- und SP1-V7A-Varianten unterschiedliche Konformations- und Bindungseigenschaften auf. Zusammenfassend liefert unsere Studie eine strukturelle Erklärung für die BVM-Resistenz sowie Leitlinien für die Gestaltung neuer MIs.

Die Reifung von HIV-1 wird durch die virale Protease ausgelöst, die den strukturellen Gag-Polyprotein-Vorläufer in seine konstituierenden Domänen spaltet1,2,3. HIV-1 Gag beherbergt fünf proteolytische Spaltstellen zwischen seinen vier wichtigsten strukturellen und funktionellen Domänen und zwei Spacer-Peptiden: MA, CA, SP1, NC, SP2 und p6. Die Verarbeitung verläuft unterschiedlich schnell, wobei die SP1-NC-Stelle am schnellsten und die CA-SP1-Stelle zuletzt gespalten wird4. Genetische und enzymatische Studien zeigten, dass die Hemmung der Spaltung oder sogar die Verlangsamung der Spaltung an der CA-SP1-Stelle ausreicht, um den Reifungsprozess erheblich zu stören und die Infektiosität des Virus aufzuheben. Tatsächlich erweisen sich Reifungsinhibitoren (MIs), die die CA-SP1-Prozessierung stören, als attraktive Kandidaten für die Erweiterung des aktuellen Arsenals an Behandlungen für HIV-Infektionen5,6,7,8,9.

Biochemische und strukturelle Studien ergaben, dass die langsame Spaltung von CA-SP1 auf die strukturelle Sequestrierung der Proteolysestelle zurückzuführen ist10,11,12,13. Innerhalb des zusammengesetzten unreifen HIV-1-Gag-Gitters faltet sich die CA-SP1-Verbindung zu einer α-Helix (der Verbindungshelix), die sich selbst zu einem 6-Helix-Bündel verbindet und so das Gag-Hexamer stabilisiert13,14. Die spaltbare Bindung zwischen CA-L231 und SP1-A1 befindet sich in der Mitte der Verbindungshelix und ist im 6-Helix-Bündel eingeschlossen. Damit die Protease Zugang zu dieser Stelle erhält, muss sich das 6-Helix-Bündel daher zumindest teilweise entfalten. Obwohl der detaillierte Mechanismus der Hemmung nicht geklärt ist, können niedermolekulare MIs wie 3-O-(3',3'-Dimethylsuccinyl)betulinsäure (Bevirimat oder BVM), 1-[2-(4-tert-) Es wird angenommen, dass Butylphenyl)-2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)ethyl]-3-(trifluormethyl)pyridin-2-on (PF-46396) und ihre Analoga durch Bindung an die Proteolyse stören die CA-SP1-Verbindung und die Stabilisierung des 6-Helix-Bündels6,7,15,16,17,18. Somit stören MIs die Substratbindung nicht direkt, sondern wirken eher indirekt, indem sie die Entfaltung des 6-Helix-Bündels hemmen und somit den Zugang der Protease zu ihrem Substrat behindern.

Obwohl MIs im Labor wirksame Inhibitoren der HIV-Infektion sind, wurden sie noch nicht für den klinischen Einsatz zugelassen. BVM durchlief klinische Studien der Phasen I und II, in denen eine signifikante, dosisabhängige Verringerung der Viruslast bei HIV-1-infizierten Personen beobachtet wurde19. Weitere Studien ergaben jedoch, dass BVM bei bis zu 50 % der Patienten keinen Einfluss auf die Viruslast hatte20,21. Diese BVM-Resistenz ist mit natürlich vorkommenden viralen Sequenzpolymorphen verbunden, insbesondere mit SP1-Aminosäureveränderungen an den Resten 7 und 8 (SP1-V7A, -V7M, -T8Δ und -T8N)20. Darüber hinaus wurden BVM-resistente Varianten durch mehrere Selektionsrunden gegen BVM in vitro erzeugt, was zu Aminosäureveränderungen in den SP1-Resten 1 und 3 (SP1-A1V, -A3T und -A3V) führte; Davon beeinträchtigt SP1-A1V die Virusreplikation nicht10.

Inositolhexakisphosphat (IP6), ein negativ geladenes kleines Molekül, das in Zellen reichlich vorhanden ist, stabilisiert auch die CA-SP1-Verbindung durch Bindung an das 6-Helix-Bündel. Im Gegensatz zu BVM, das in der Mitte des Helixbündels bindet14,18, befindet sich IP6 direkt über dem 6-Helixbündel und bildet Salzbrücken mit zwei Ringen aus Lysinseitenketten (CA-K158 und CA-K227)22. Obwohl BVM auch negativ geladene Carboxylate enthält, ist nicht geklärt, ob diese mit IP6 um die Interaktion mit den Lysinringen konkurrieren können.

Um zu beurteilen, wie MIs an die CA-SP1-Stelle binden, und um die Mechanismen aufzuklären, die der BVM-Resistenz zugrunde liegen, haben wir atomar aufgelöste Magic Angle Spinning (MAS)-NMR-Strukturen von mikrokristallinen Komplexen eines HIV-1-Gag-Fragments bestimmt, das die C-terminale CA-Domäne überspannt (CACTD) und SP1-Regionen (CACTD-SP1) in Gegenwart von BVM und/oder IP6. Strukturen wurden auf der Grundlage einer großen Anzahl von Abstandsbeschränkungen berechnet, die aus Kohlenstoff-Kohlenstoff- und Kohlenstoff-Proton-Korrelationen in hochwertigen Spektren abgeleitet wurden. Durch intermolekulare Korrelationen zwischen Liganden- und Proteinresonanzen konnten wir die gleichzeitige Bindung von BVM und IP6 verifizieren und die Bindungsorientierung eines BVM-Moleküls innerhalb des 6-Helix-Bündels der CA-SP1-Verbindung eindeutig zuordnen. Insgesamt liefern die hier beschriebenen Strukturen beispiellose Details auf atomarer Ebene darüber, wie BVM und IP6 mit CACTD-SP1 interagieren, die mit anderen Strukturtechniken nicht verfügbar sind, und erklären die strukturellen Grundlagen der BVM-vermittelten Reifungshemmung und Resistenz von SP1-A1V und SP1- V7A-Varianten. Unsere Studie unterstreicht auch die Leistungsfähigkeit der MAS-NMR-Spektroskopie zur direkten Beobachtung und strukturellen Charakterisierung gebundener kleiner Moleküle in großen makromolekularen Anordnungen mit Details auf atomarer Ebene.

Negativ gefärbte Transmissionselektronenmikroskopiebilder (TEM) bestätigten frühere Ergebnisse, dass CACTD-SP1 in Gegenwart von IP622 mikrokristalline Anordnungen bildete und dass die Anordnungen in Gegenwart oder Abwesenheit von BVM ähnlich aussahen (Abb. 1a). MAS-NMR-Experimente wurden mit elf Probensätzen durchgeführt, die mit unterschiedlichen Kombinationen von Isotopenmarkierungen und in Gegenwart oder Abwesenheit von BVM und/oder IP6 hergestellt wurden (zusammengefasst in der Ergänzungstabelle 1). Insgesamt wurden vierzehn eindimensionale (1D), einundsiebzig zweidimensionale (2D) und sechs dreidimensionale (3D) Spektren aufgenommen. Die Sensitivität und Auflösung der Datensätze sind außergewöhnlich hoch und ermöglichten nahezu vollständige (96 %) Rückgratresonanzzuordnungen. Insgesamt wurden 8377 Kreuzpeaks zugeordnet (Tabelle 1; alle Zuordnungen sind in der ergänzenden Abbildung 1 und den ergänzenden Daten 1 zusammengefasst). Wichtig ist, dass die MAS-NMR-Spektren klare Signaturen der chemischen 13C-Verschiebung für reife und unreife Gitter liefern (siehe ergänzende Abbildung 2). Alle CACTD-Schwanz- und SP1-Reste mit Ausnahme von SP1-M14 führen zu deutlichen, gut aufgelösten Peaks in den MAS-NMR-Spektren (in Abb. 1b für einen Abschnitt der SP1-Reste Q6 bis I13 dargestellt). Wichtig ist, dass die Resonanzen der C-terminalen Schwanzreste G144-S146 und SP1-Schwanzreste T8-I13, die in Röntgen-13-, microED18- und Kryo-ET23-Strukturen fehlen, in den MAS-NMR-Experimenten direkt erfasst und zugeordnet wurden. Die Ausrichtung des C-terminalen Schwanzes an der interhexameren Grenzfläche des CACTD-SP1-Kristallgitters wird durch eindeutige Zuordnung der in MAS-NMR-Spektren gefundenen G145-W184-Korrelationen definiert (Abb. 1c). Die sekundären chemischen Verschiebungen weisen eindeutig darauf hin, dass die SP1-Reste 1–10 in Abwesenheit und Anwesenheit von BVM helikal sind. Eine solche helikale Konformation stimmt vollständig mit der bekannten 6-Helix-Bündelstruktur von SP1 im unreifen Gag-Gitter überein13,14,18,22, im Gegensatz zur Struktur in hochsalzassembliertem CA-SP1 ohne IP6, wo SP1-Reste dynamisch ungeordnet sind. wie zuvor beschrieben24.

a Negativ gefärbte TEM-Bilder von mit IP6 zusammengesetzten CACTD-SP1-Mikrokristallen in Gegenwart (links) oder Abwesenheit von BVM (Mitte). Einfügungen zeigen die berechneten Fourier-Transformationen der Bilder und geben die erwarteten hexagonalen Gitter und Elementarzellenabstände an. Die Maßstabsbalken sind 100 nm. Aminosäuresequenz von CACTD-SP1 (rechts). b Repräsentative Streifen von 3D- und 2D-MAS-NMR-Spektren der kristallinen Arrays U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4 (weiße Streifen) und U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 (graue Streifen) zur Veranschaulichung der sequentiellen Zuordnungen für SP1-Reste Q6-I13. Die MAS-NMR-Spektren sind wie folgt gekennzeichnet: 3D NCACX (1), 3D NCOCX (2), 2D NCACX bei −79 °C (3), 2D UNGENÜGEND (4), 2D NCOCX bei −79 °C (5), 2D KABEL (6), 2D NCACX (7). Für die freien Proben im Vergleich zu BVM- oder IP6-gebundenen Proben wurden keine signifikanten Störungen der chemischen Verschiebung festgestellt (siehe ergänzende Abbildung 3). c Oberes Feld: Überlagerung ausgewählter Bereiche von 2D-CORD-Spektren von U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6-Kristallarrays für verschiedene Mischzeiten: 100 ms (Magenta) und 500 ms (Grau). Mittleres Feld: Überlagerung ausgewählter Regionen von 2D-NCACX- (Cyan) und 2D-PAIN-CP-Spektren (Grau) von U-13C-, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6-Kristallarrays. Eindeutige Fernkorrelationen und Korrelationen zwischen Resten von SP1-Resten werden durch die Aminosäurenummer in der Sequenz gekennzeichnet. Unteres Feld: Inter-Hexamer-Korrelationen werden für die ausgewählten Bereiche der 2D-CORD- (links) und CH-HETCOR-Spektren (Mitte) von U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 und (H)NH HETCOR (rechts) angezeigt. Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (Puffer B). d Anzahl der langreichweitigen und aller Restrest-MAS-NMR-Beschränkungen pro Rest, aufgetragen gegen die Restzahl. e Seitenansicht des Hexamers von Hexameren von BVM- und IP6-gebundenen CACTD-SP1-Arrays. f Erweiterung der Regionen zwischen Hexamer (oberes Feld) und zwischen Ketten (unteres Feld) mit Abständen, die aus MAS-NMR-Korrelationsexperimenten erhalten wurden. g MAS-NMR-Struktur eines einzelnen Hexamers der BVM- und IP6-gebundenen CACTD-SP1-Kristallanordnung. Die durch MAS-NMR nachgewiesenen und nicht in den Röntgen- und Kryo-EM-Strukturen13, 14 modellierten Rückstände sind in dunklerem Cyan dargestellt.

In mehreren MAS-NMR-Spektren wurde eine große Anzahl von Intra-Protein-Korrelationen nachgewiesen (Abb. 1c), und aufgrund der hervorragenden Auflösung waren keine mit 13C-Isotopen verdünnten Proben erforderlich, um intramolekulare von intermolekularen Korrelationen zu unterscheiden: Alle Kreuzpeaks sind gut aufgelöst und könnten eindeutig zugeordnet werden, wodurch Abstandsbeschränkungen abgeleitet werden können. Insgesamt wurden 3048 nichtredundante, eindeutige Protein-Protein-Abstandsbeschränkungen (13C-13C, 15N-13C, 13C-1H und 15N-1H) erhalten, darunter 674 mittlere (1< |ij | <4), 627 weitreichend (|ij | ≥5), mit 39 weitreichenden Inter-Chain- und 22 weitreichenden Inter-Hexamer-Beschränkungen. Mit fast 30 nicht-redundanten eindeutigen Beschränkungen pro Rest oder über 52 % Vollständigkeit der CC-Beschränkungen (siehe Tabelle 2) und einer sehr großen Anzahl von Beschränkungen zwischen Resten (1754), die unseres Wissens aus Langzeitkorrelationen abgeleitet wurden (Abb. 1d). Diese Studie ergab die höchste Anzahl an Abstandsbeschränkungen aller bisherigen Protein-MAS-NMR-Untersuchungen.

Wir haben direkte Korrelationen zwischen der natürlichen Häufigkeit kleiner Moleküle IP6 und BVM und dem isotopenmarkierten Protein festgestellt. Für IP6 wurden Korrelationen zwischen CA-K158Cε und IP6-H2/H4/H6 beobachtet, was darauf hindeutet, dass CA-K158 die IP6-Bindung vermittelt. Sie wurden in 6 Restriktionen übersetzt, die zwei benachbarte Ketten im 6-Helix-Bündel für jedes der drei IP6-Protonen einbeziehen. Darüber hinaus wurde eine sehr schwache Korrelation mit CA-K227Cδ beobachtet. Korrelationen mit BVM führten zu 7 Abstandsbeschränkungen, die die Bindungsorientierung des Inhibitors innerhalb des 6-Helix-Bündels eindeutig definierten. Diese Korrelationen sind in Abb. 2a zusammengefasst. Eine Zusammenfassung aller Abstandsbeschränkungen finden Sie in Tabelle 2 und eine Darstellung aller Kontakte zwischen den Resten ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.

a Überlagerung ausgewählter Regionen von 2D-HC-CP-HETCOR-Spektren (obere drei Felder) und 2D-dREDOR-HETCOR-Spektren (unteres Feld) von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (grau) und U-13C, 15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (Cyan) Baugruppen. Die BVM- und IP6-1H-Atome sowie die CACTD-SP1-Reste mit 13C-Atomen sind außerhalb bzw. innerhalb jedes Spektrums angegeben. b Chemische Identität von IP6- und BVM-Molekülen. Die IP6- und BVM-Protonen, die mit CACTD-SP1-Resten interagieren, sind in Cyan bzw. Grau dargestellt. c Oberes Feld: IP6-Bindungsmodus im Hexamer von CACTD-SP1/IP6-Baugruppen (dunkles Cyan, PDB: 7R7Q, diese Arbeit). Unteres Feld: IP6- und BVM-Bindungsmodi im Hexamer von CACTD-SP1/BVM/IP6-Baugruppen (grau, PDB: 7R7P, diese Arbeit). Rückstände, die mit IP6 oder BVM interagieren, werden als Stäbchen angezeigt. d Überlagerung der MAS-NMR-Struktur von CACTD-SP1/BVM/IP6 und CACTD-SP1/IP6, dargestellt in Seitenansicht (oben) und Draufsicht (unten). Die BVM-Bindung induziert große strukturelle Umlagerungen der SP1-Helices, was zu einer Verengung der Pore und einer Unterdrückung der Bewegungen des gleichzeitig gebundenen IP6 führt. Magentafarbene Rückstände führen zu Peaks mit hoher Intensität, die den Korrelationen innerhalb und zwischen den Rückständen bei der BVM-Bindung entsprechen.

Die Struktur einer einzelnen Kette von CACTD-SP1 wurde nur unter Verwendung experimenteller MAS-NMR-Abstandsbeschränkungen und Diederbeschränkungen berechnet. Diese Struktur wurde verwendet, um Proteinstrukturen höherer Ordnung im Komplex mit BVM und IP6 zu berechnen (Einzelheiten zur Strukturberechnung finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“). Strukturen höherer Ordnung (Abb. 1e) wurden durch Integration der experimentellen MAS-NMR-Beschränkungen (dh Protein-Protein-, Protein-BVM- und Protein-IP6-Abstands- und Protein-Torsionswinkel-Beschränkungen) berechnet und eine Hexamer-aus-Hexamer-Strukturhülle erzeugt aus Röntgenkoordinaten des CACTD-SP1-Hexamers (PDB: 5I4T)13. Die Hexamer-aus-Hexamer-Einheit stellt den minimalen Baustein dar, der die kritischen Interhexamer-Grenzflächen im unreifen Kapsidgitter rekapituliert. Die MAS-NMR-abgeleiteten CACTD-SP1-Kontakte zwischen den Ketten und zwischen den Hexamern sind in Abb. 1f dargestellt.

Wie zuvor beschrieben13,14,18,22 weist das CACTD-SP1-Hexamer die Form eines Bechers auf, wobei die globuläre CACTD-Domäne den Becher und die 6-Helix-Bündel-CA-SP1-Verbindung den Stamm bildet. In der Kristallstruktur von CACTD-SP1 und der Kryo-EM-Struktur von Gag voller Länge endet die Verbindungshelix um den Rest SP1-V7 herum, wobei die verbleibenden Reste nicht sichtbar sind, was wahrscheinlich auf eine Konformationsstörung zurückzuführen ist13,18,22. Bemerkenswerterweise ist die gesamte SP1-Region, einschließlich des SP1-Schwanzes, mit Ausnahme von SP1-M14, in den MAS-NMR-Strukturen gut definiert (Abb. 1g und ergänzende Abb. 5 und 6). Chemische MAS-NMR-Verschiebungen sagen eine helikale Konformation bis SP1-T10 voraus, wobei die letzten 4 Reste (A11-M14) eine zufällige Knäuelstruktur aufweisen (Abb. 1g). Für SP1-E2-, S5-, T8-, N9-, T10-, T12- und I13-Reste sind die Peakintensitäten niedrig, was auf eine Konformationsheterogenität hindeutet (Abb. 1b), was mit den Röntgen-13- und Kryo-EM-Daten14 übereinstimmt.

In der BVM-gebundenen Struktur befindet sich der Inhibitor innerhalb des durch das 6-Helix-Bündel gebildeten Kanals, wobei der Sterolring das hydrophobe Innere des Kanals besetzt und Kontakte mit den Proteinresten CA-H226, K227, L231 und SP1 herstellt. M4. Die Dimethylsuccinyl-Einheit ist auf den CACTD-Becher ausgerichtet, wie durch die Korrelationen H32(BVM)-P224Cβ(Protein) und H3(BVM)-K227Cβ(Protein) eindeutig angezeigt wird, während die Vinylgruppe auf den SP1-Schwanz zeigt, wie durch H19 nahegelegt (BVM)-L231Cβ(Protein)- und H29(BVM)-L231Cβ(Protein)-Korrelationen (Abb. 2a, b). Somit wird experimentell eine einzige BVM-oben-Ausrichtung beobachtet, im Gegensatz zu den Schlussfolgerungen einer kürzlich durchgeführten Computerstudie, in der sowohl BVM-oben- als auch BVM-unten-Orientierungen für möglich gehalten wurden.25 Darüber hinaus interagieren L231 und SP1-M4 asymmetrisch mit Die BVM-Vinylgruppe, d. h. 3 von 6 Ketten des 6-Helix-Bündels, weisen direkte Kontakte mit BVM auf. Diese Einsicht in die asymmetrischen Wechselwirkungen von BVM mit Proteinseitenketten ist in keiner der früheren Strukturen verfügbar.18,25,26 Interessanterweise deutete eine kürzlich durchgeführte Computerstudie darauf hin, dass BVM innerhalb der CACTD-SP1-Hexamerpore auf der Zeitskala der MD rotiert Simulation und kontaktiert während dieses Prozesses verschiedene Protomere.25 Es wurde auch vermutet, dass BVM über alle sechs Helices gleichmäßig mit L231 interagiert, während bevorzugte Wechselwirkungen mit einigen SP1-M4-Resten beobachtet werden. Unsere experimentellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass BVM im Nano- bis Mikrosekundenbereich keine Bewegungen innerhalb des Sechs-Helix-Bündels ausführt und dass die für alle interagierenden Reste, einschließlich L231 und SP1-M4, beobachtete Asymmetrie der BVM-Bindung an das Protein statischen Charakter hat. Zusammenfassend bestätigt unsere Struktur, dass BVM die CA-SP1-Verbindung durch Bindung innerhalb des zentralen Kanals des 6-Helix-Bündels14,18 organisiert, die Symmetrie in Bezug auf die Seitenketten bricht und, was wichtig ist, die Ausrichtung des gebundenen Arzneimittels definiert.

Ein Vergleich der Strukturen in Gegenwart und Abwesenheit von BVM zeigt deutlich, dass die BVM-Bindung zu einer scheinbaren Verengung der Hexamerpore führt (Abb. 2c, d) durch strukturelle Neuordnung in den Typ-II-β-Turn- und CA-SP1-Verbindungshelices. Dieser hier entdeckte Mechanismus der Porenverengung wurde in einer früheren microED-Studie nicht beschrieben18 (ergänzende Abbildung 7). Interessanterweise wurde in einer zuvor veröffentlichten Festkörper-NMR-Untersuchung der BVM-Bindung an virusähnliche Partikel (VLPs) die Möglichkeit einer Destabilisierung des Segments vor der Verbindungshelix aufgrund der BVM-Bindung diskutiert, obwohl dies nicht direkt durch experimentelle Daten gestützt wurde27. Diese Ergebnisse stimmen mit unserer Beobachtung der Porenverengung und der unterschiedlichen Position der Typ-II-β-Windung (G220-P224) in Gegenwart von BVM überein (Abb. 2d). Wir beobachteten auch eine ausgeprägte Konformationsheterogenität von CA-P157, K158, E159 und SP1-M4, was auf eine Asymmetrie der sechs Proteinseitenkettenkopien im hexameren Ring hinweist. Dieses Ergebnis liefert einen weiteren Beweis dafür, dass ein einzelnes asymmetrisches BVM-Molekül innerhalb des 6-Helix-Bündels gebunden ist (ergänzende Abbildung 8). Darüber hinaus wird der SP1-Schwanz bei der BVM-Bindung weniger dynamisch, was sich in der erhöhten Intensität der Kreuzpeaks der Schwanzreste zeigt, zusammen mit einer damit einhergehenden Neuorientierung der Seitenketten von Resten in der Nähe der Bindungsstelle, wie CA-P157, K158, E159, N195, G220, V221, G222, G223, P224, K227, V230, L231 und SP1-E2 (Abb. 2d und 3a, obere Platten und ergänzende Abb. 9). Wir vermuten, dass diese strukturellen Veränderungen alle zur stabilisierenden Wirkung der BVM-Bindung beitragen.

a Überlagerung ausgewählter Bereiche der 2D-HC-CP-HETCOR-Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (grau) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (cyan) (oberes Feld). ); U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (Magenta) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (hellgrün) (mittleres Feld); und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (orange) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (lila) (Unterseite). Intra- und Inter-Rest-Korrelationen, die sich aus der BVM-Bindung ergeben, sind nur in WT CACTD-SP1, nicht jedoch in CACTD-SP1-V7A oder CACTD-SP1-A1V gekennzeichnet. Reste, die mehrere Konformere aufweisen, werden mit a, b, c bezeichnet. b Überlagerung ausgewählter Bereiche der 2D-CORD-Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (grau) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (cyan) (oberes Feld); U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (Magenta) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (hellgrün) (mittleres Feld); und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (orange) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (lila) (Unterseite). Kreuzpeaks innerhalb der Rückstände, die Intensitäts- oder chemische Verschiebungsänderungen aufgrund der BVM-Bindung in WT CACTD-SP1 aufweisen, sind markiert. Die entsprechenden Korrelationen fehlen entweder oder weisen geringfügige Störungen der chemischen Verschiebung bei der BVM-Bindung an CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 und in CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 auf. c Oben und Mitte: 31P-Direktpolarisationsspektren (DP, oben) und Kreuzpolarisationsspektren (CP, Mitte) von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (grau), U-13C,15N,2H- CACTD-SP1/IP6 (Cyan), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (Magenta), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (Hellgrün), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (orange) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (lila). Unten: Überlagerung der 2D (H)PH HETCOR-Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (grau) und U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (magenta). ) (links). Gekippte Ausrichtung von IP6 in WT CACTD-SP1/BVM/IP6 (Mitte) (PDB: 7R7P, diese Arbeit). Horizontale Ausrichtung von IP6 in CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (rechts). d Störungen der chemischen Verschiebung, die durch die BVM-Bindung in WT CACTD-SP1 (oben), CACTD-SP1-V7A (Mitte) und CACTD-SP1-A1V (unten) hervorgerufen werden, aufgetragen gegen die Restzahl. e CACTD-SP1/BVM/IP6-Struktur mit Resten, die einzigartige CSPs, Intra- und Inter-Rest-Korrelationen und erhöhte Peakintensitäten bei BVM-Bindung an WT CACTD-SP1 aufweisen, dargestellt in Blau.

Wichtig ist, dass unsere Daten zeigten, dass BVM und IP6 gleichzeitig an das CACTD-SP1-Hexamer binden können, wie kürzlich vorgeschlagen25,26,28. Dies wird durch die Beobachtung unterschiedlicher Korrelationen zwischen IP6 und CACTD-SP1 in Gegenwart und Abwesenheit von BVM gestützt. Wichtig ist, dass die Art der Interaktion zwischen IP6 und CACTD-SP1 in Gegenwart und Abwesenheit von BVM unterschiedlich ist. Insbesondere zeigen die Datensätze 1H-13C HETCOR und dREDOR-HETCOR Korrelationen zwischen mehreren Protonen von BVM (H3, H16, H19, H23, H24, H29, H32) und IP6 (H2, H4, H6) mit unterschiedlichen CACTD-SP1-Resten (Abb. 2a), was bedeutet, dass die Bindung von IP6 und BVM nicht konkurrenzfähig ist. In Abwesenheit von BVM bindet IP6 nahezu horizontal im Halsbereich des Kanals innerhalb des 6-Helix-Bündels, koordiniert durch sechs CA-K158- und sechs CA-K227-Reste. Diese Konfiguration wird durch Korrelationen zwischen der IP6-H2/H4/H6-Resonanzgruppe (chemische Verschiebungen liegen zu nahe, um einzelnen Atomen zugeordnet werden zu können) und den Cε-Atomen von sechs CA-K158-Seitenketten gestützt (Abb. 2a). Es wird eine schwache H2/H4/H6(IP6)-Korrelation mit CA-K227Cδ beobachtet, was einen spezifischen Kontakt zwischen IP6 und diesem Rest bestätigt, was mit jüngsten Berichten übereinstimmt22. Interessanterweise werden in den 1H-31P-1D-CPMAS- oder 2D-HETCOR-Spektren keine äquivalenten Korrelationen beobachtet (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass die Koordination durch die zwölf Lysinreste dynamisch gemittelt wird und IP6 lokale Bewegungen innerhalb der Pore durchläuft. Im Gegensatz dazu erscheinen bei gebundenem BVM drei intensive Kreuzpeaks im 2D (H)PH HETCOR-Spektrum von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (Abb. 3c), was Korrelationen zwischen drei verschiedenen entspricht Phosphoratome von IP6 und die Seitenketten der CA-K158-, K227- und P224-Reste. Das Vorhandensein intensiver Kreuzpeaks deutet darauf hin, dass die Bewegung von IP6 in Gegenwart von BVM gestoppt wird. Ob das Anhalten der IP6-Bewegung mit der Stabilisierung des 6-Helix-Bündels zusammenhängt, ist derzeit unklar, obwohl die gebundene IP6-Dynamik zur Beurteilung der MI-Aktivität verwendet werden kann (siehe unten).

Das Verständnis der Resistenzmechanismen gegen MI-Inhibitoren ist für die weitere Entwicklung solcher Moleküle wie Arzneimittel von entscheidender Bedeutung. Wir haben daher untersucht, wie sich CACTD-SP1-Varianten, die mit BVM-Resistenz verbunden sind, auf die Bindung auswirken. CACTD-SP1-Anordnungen, die die SP1-A1V- und V7A-Substitutionen enthalten, wurden hergestellt und 2D-1H-13C-HETCOR-, 13C-13C-CORD-, 1D-31P-DP- und CPMAS- sowie 2D-(H)PH-HETCOR-Spektren in An- und Abwesenheit von BVM und aufgezeichnet /oder IP6 (Abb. 3a–c). In Abwesenheit von BVM sind die Peakintensitäten für die meisten SP1-Reste in den A1V- und V7A-Varianten erheblich niedriger als für das Wildtyp-Protein (WT), und viele mit anderen Regionen verbundene Korrelationen fehlen (ergänzende Abbildung 10). Dieses Ergebnis zeigt, dass die SP1-Regionen in beiden Varianten von Natur aus dynamischer sind als im WT-Protein. Ein Vergleich der durch BVM induzierten 13C-chemischen Verschiebungsstörungen (CSPs) für den WT und die beiden Varianten A1V und V7A ergab die umfangreichsten CSPs für die WT-Anordnungen, insbesondere für Resonanzen, die mit Resten in SP1 (M4, S5, T8, T10, A11), die Typ-II-β-Schleife (CA-G223, G225) und die Verbindungshelix (CA-H226) (Abb. 3d, e). Für die A1V-Variante fanden wir keine der Protein-BVM-Korrelationen, die mit WT CACTD-SP1 beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass BVM sehr schwach bindet, sehr mobil ist oder überhaupt nicht bindet (ergänzende Abbildung 11). Im Gegensatz dazu beobachteten wir bei V7A bescheidene, aber statistisch signifikante CSPs, was darauf hindeutet, dass diese Variante effizienter an BVM gebunden ist als A1V (aber weniger effizient als WT). Interessanterweise machte die BVM-Bindung an die V7A-Anordnungen den Komplex im Gegensatz zu den Beobachtungen für WT CACTD-SP1 nicht starrer, da keine der äquivalenten Korrelationen in den MAS-NMR-Spektren vorhanden ist (Abb. 3a, b). In Übereinstimmung mit den CSP-Daten wurden 31P-Signale von IP6 in 1D-31P-CPMAS-Spektren von CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6-Baugruppen beobachtet (Abb. 3c), ähnlich den Ergebnissen für WT CACTD-SP1/BVM/IP6 fehlen in CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6-Proben. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass IP6 in Gegenwart von BVM in CACTD-SP1-V7A-Baugruppen bewegungsbeschränkt ist, in Baugruppen von CACTD-SP1-A1V jedoch mobil ist. Darüber hinaus deutet die Dynamik von IP6 in CACTD-SP1-A1V eher auf einen Verlust der BVM-Bindung als auf eine schwache Bindung hin. Unsere Daten korrelieren gut mit Beobachtungen aus virologischen Studien29,30 und zeigen, dass virusähnliche Partikel (VLPs), die die SP1-A1V-Mutation tragen, BVM weniger effizient binden als WT 30. In einer früheren Studie zur Molekulardynamik25 wurde der Verlust der Symmetrie der 6 -Helix-Bündel wurde ebenfalls beobachtet. Darüber hinaus ist die CA-SP1-Verarbeitung in mutierten SP1-A1V-Virionen im Vergleich zum WT-Virus schneller, was mit der Annahme übereinstimmt, dass die SP1-A1V-Variante ein konformativ dynamischeres 6-Helix-Bündel besitzt10,25. Im Gegensatz dazu ist die CA-SP1-Verarbeitung in SP1-V7A- und WT-Virionen ähnlich21, was auf unterschiedliche BVM-Resistenzmechanismen für die SP1-V7A- und SP1-A1V-Sequenzvarianten schließen lässt29. Zusammengenommen legen unsere MAS-NMR-Ergebnisse nahe, dass unterschiedliche Mechanismen mit dem Verlust der BVM-Bindung an MI-resistente Varianten verbunden sein können.

2D (H)PH HETCOR-Spektren von WT CACTD-SP1/BVM/IP6- und CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6-Anordnungen zeigen deutliche 31P(IP6)-1H(Protein)-Kreuzpeaks (Abb. 3c). Für das WT-Protein liegen drei Korrelationen vor: P4/6(IP6)-K158Hε2(Protein), P5(IP6)-K227Hε2(Protein) und P4/6(IP6)-P224Hδ2(Protein). Für CACTD-SP1-V7A werden Korrelationen zwischen P1/3/4/6(IP6)-P157Hδ2(Protein), P2(IP6)-K158Hα(Protein) und P4/6(IP6)-P160Hα(Protein) beobachtet (Abb . 3c und ergänzende Abb. 12 und 13). Im Gegensatz dazu sind in den CACTD-SP1-A1V-Spektren keine Korrelationen zu erkennen, was darauf hindeutet, dass IP6 dynamisch ist. Für WT CACTD-SP1 lässt die Korrelation zwischen einem einzelnen Phosphoratom (P5) von IP6 und SP1-K227Hε2 darauf schließen, dass IP6 nur einem der sechs CA-K227-Reste gegenübersteht. Die Tatsache, dass in den WT-CACTD-SP1-Spektren keine Korrelationen zu P2 und P1,3 erkennbar sind, steht im Einklang mit einer geneigten Ausrichtung von IP6 (Abb. 3c). Für die SP1-V7A-Variante lässt das Fehlen von IP6-Korrelationen mit CA-K227 zusammen mit dem Vorhandensein von IP6-Korrelationen mit CA-P157, K158 und P160 darauf schließen, dass IP6 im Halsbereich eine horizontale Ausrichtung einnimmt (Abb. 3c). . Wir gehen davon aus, dass die unterschiedlichen dynamischen Eigenschaften und Orientierungen, die IP6 in den WT-, SP1-A1V- und SP1-V7A-Proteinanordnungen annimmt, mit der BVM-Inhibitoraktivität gegen die resistenten Viren korrelieren könnten, was auf die verlockende Möglichkeit schließen lässt, dass 31P-MAS-NMR von IP6-gebundenen Anordnungen dies könnte für das MI-Screening entwickelt werden.

Hier präsentierten wir MAS-NMR-Strukturen des CACTD-SP1-Gitters im Komplex mit IP6 in Gegenwart oder Abwesenheit von BVM, die Details von Protein-Ligand-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene offenbaren. Insbesondere bestätigen unsere Daten, dass BVM gleichzeitig mit IP6 in der Pore des CACTD-SP1-6-Helix-Bündels bindet. Wichtig ist, dass wir die Bindungsorientierung beider Liganden eindeutig definiert und gezeigt haben, dass BVM eine Porenverengung verursacht, die mit strukturellen Umlagerungen von Resten in den SP1-Helices verbunden ist, und die Dynamik des gleichzeitig gebundenen IP6 unterdrückt, was mit der Stabilisierung des 6-Helix-Bündels vereinbar ist14,15, 16,18,25,31. Darüber hinaus haben wir bisher unbekannte Auswirkungen von BVM auf die Hemmung der IP6-Dynamik und die Abschwächung der Seitenkettenbewegungen der CACTD-SP1-Reste, die mit IP6 interagieren, entdeckt, die zusammen dazu beitragen könnten, den Protease-Zugriff auf die CA-SP1-Spaltungsstelle zu verhindern. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass die BVM-Resistenz in den Varianten SP1-A1V und SP1-V7A mit dem Verlust der MI-Bindung bzw. dem Verlust einer stabilen 6-Helix-Bündelkonformation verbunden ist.

Unsere Studie liefert nicht nur wichtige molekulare Erkenntnisse über BVM-vermittelte Effekte auf die Gag-Reifung, sondern stellt auch einen großen technologischen Fortschritt in der MAS-NMR dar, der über häufig verwendete Ansätze zur Charakterisierung gebundener Liganden hinausgeht, die ihre 13C-Isotopenmarkierung erfordern. Dies war durch die sinnvolle Nutzung der 1H-Resonanzen von BVM sowie der 1H- und 31P-Resonanzen von IP6 möglich. Darüber hinaus erwiesen sich die Deuterierung von CACTD-SP1 und dREDOR-gefilterte Experimente als entscheidend für diesen Zweck. Schließlich war für die vorliegenden MAS-NMR-Strukturen von Anordnungen höherer Ordnung keine 13C-Isotopenverdünnung erforderlich.

Zusammengenommen klären die hier vorgestellten Ergebnisse nicht nur die atomaren Details der BVM-Bindung an HIV-1 CACTD-SP1 auf und informieren über BVM-Resistenzmechanismen, sondern können auch neue Strategien für die Entwicklung wirksamerer MIs der nächsten Generation vorschlagen.

Das Expressionsplasmid für das CACTD-SP1-Fragment des HIV-1-Stammes NL4-3 Gag, das einen nicht spaltbaren His-Tag und die Mutation P373T (SP1-P10T) enthält, wurde zuvor beschrieben13. Die SP1-V7A- und A1V-Mutationen wurden durch Quikchange-Mutagenese (Agilent) in das Konstrukt eingeführt. Das SP1-T10-Sequenzpolymorph weist die gleichen Infektiositäts- und antiviralen BVM-Aktivitätsprofile (IC50) auf wie SP1-P10, wie in der ergänzenden Abbildung 14 gezeigt. Proteine wurden in transformierten E. coli BL21 (DE3)-Zellen exprimiert, in denen gezüchtet wurde In einem Schüttelinkubator bei 37 °C bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD600 von 0,6–1) inkubiert und dann über Nacht bei 18 °C mit 1 mM IPTG induziert. Die Expression von U-13C,15N-angereicherten und U-13C,15N,2H-angereicherten CACTD-SP1-Proteinen erforderte zusätzliche Vorkultivierungsschritte, um die Zellen langsam von reichhaltigem Medium an minimales Medium anzupassen, und wurde wie zuvor berichtet durchgeführt32,33. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Die Proteinreinigung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt13. Kurz gesagt, Bakterienpellets wurden in 50 mM Tris, pH 8,3, 1 M LiCl, enthaltenden Proteaseinhibitortabletten (Roche) resuspendiert und mit 0,3 % (Gew./Vol.) Desoxycholat ergänzt. Die Zellen wurden durch Inkubation mit Lysozym und anschließende Ultraschallbehandlung lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt, filtriert und mit Ni-NTA-Agaroseharz (Qiagen) 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Ungebundene Fraktionen wurden abgewaschen und gebundenes Protein wurde durch einen Stufengradienten von 15 mM Imidazol bis 300 mM Imidazol eluiert. Das Protein wurde mittels Anionenaustauschchromatographie in 20 mM Tris, pH 8,0, 0,5 M NaCl bis zur Homogenität gereinigt. Reines Protein wurde auf 10 mg/ml konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Es wurden zwei Sätze von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6-Proben hergestellt, einer in Puffer A (20 mM Tris, pD 8,0, 0,5 M NaCl; hergestellt aus 1 M Tris-Stammlösung mit 99,9 % Reinheit in D2O (Cambridge). ) und pD angepasst mit Deuteriumchlorid (Sigma), hergestellt in D2O mit 99,9 % Reinheit (Cambridge) und der zweite in Puffer B (20 mM Tris, pH 8,0, 0,5 M NaCl). Die Proteinproben in Puffer A wurden durch Pufferaustausch wie folgt vorbereitet: 0,5 ml Protein mit 10 mg/ml wurden mit Puffer A auf 10 ml verdünnt und dann viermal durch Zentrifugation erneut konzentriert. Nach dem Austausch wurden die Proben in einem Endvolumen von 0,5 ml mit Konzentrationen zwischen 9 und 10 mg/ml gewonnen.

Die Proteine wurden mit 1,6 mM IP6 (Sigma-Aldrich) und 1,4 mM BVM (Sigma-Aldrich) in einem Endreaktionsvolumen von 1 ml zusammengesetzt. Einige Proben, die zum Erhalten oder Bestätigen von Resonanzzuordnungen verwendet wurden, wurden durch Mischen von Protein mit gleichen Volumina von 1,5 M Ammoniumsulfat (Sigma-Aldrich), 0,1 M Tris, pH 8,5, zusammengestellt. Die Zusammenstellungen wurden über Nacht inkubiert. Optimale Anordnungen wurden bei Inkubationstemperaturen von 16–20 °C erhalten. U-13C,15N-markierte Anordnungen (~50 mg Protein) wurden bei 10000 x g zentrifugiert und in dünnwandige 3,2-mm-Bruker-Rotoren verpackt. Pufferausgetauschte Proteinanordnungen (~17 mg Protein) wurden bei 10.000 x g zentrifugiert und in 1,9-mm-Bruker-Rotoren verpackt.

Die Aktivität von BVM gegen SP1-P10 und das SP1-T10-Derivat wurde im Wesentlichen wie zuvor berichtet29 bestimmt. Kurz gesagt, HEK 293 T-Zellen (ATCC, Kat.-Nr. CRL-3216) wurden mit pNL4-3/SP1-P10- oder pNL4-3/SP1-T10-Molekülklonen transfiziert und die transfizierten Zellen wurden mit 24 BVM-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 100 % behandelt bis 10 μM. Virushaltige Überstände wurden geerntet, auf Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT) normalisiert und zur Infektion der TZM-bl-Indikatorzelllinie verwendet. Die Infektiositätsdaten wurden mit GraphPad Prism 7 aus drei unabhängigen Experimenten analysiert. Die Kurven wurden mithilfe einer nichtlinearen Regression als Logarithmus (Inhibitor) gegenüber der normalisierten Reaktion angepasst, mit einer variablen Steigung unter Verwendung einer Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate (normal).

Um die relative Infektiosität von SP1-P10 im Vergleich zum SP1-T10-Derivat zu messen, wurden HEK 293 T-Zellen mit den molekularen Klonen pNL4-3/SP1-P10 oder pNL4-3/SP1-T10 transfiziert. Virushaltige Überstände wurden geerntet, auf RT-Aktivität normalisiert und zur Infektion der TZM-bl-Indikatorzelllinie verwendet. Die Luciferase-Aktivität wurde 2 Tage nach der Infektion gemessen. Die spezifischen Infektiositäten werden relativ zu denen des SP1-P10 (100 %) dargestellt. Fehlerbalken geben Standardabweichungen an (n = 4 unabhängige Tests, die doppelt durchgeführt wurden) (ergänzende Abbildung 14).

MAS-NMR-Experimente an U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4, U-13C,15N- CACTD-SP1/SO4-Kristallarrays wurden auf einem 20,0-T-Bruker-AVIII-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 3,2-mm-E-Free-HCN-Sonde ausgestattet war. Die MAS-Frequenz betrug 14 kHz und wurde von einem Bruker-MAS-Controller auf ±10 Hz genau gesteuert. Die tatsächliche Probentemperatur wurde während der Experimente bei 4 ± 1 °C und bei einigen spezifischen Experimenten unter Verwendung des Bruker-Temperaturreglers bei –10 ± 1 °C gehalten. Die Larmorfrequenzen betrugen 850,4 MHz (1H), 213,9 MHz (13C) und 86,2 MHz (15N) bei 20,0 T. Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 2,6–3,0 μs für 1H und 4,3–4,5 μs für 13C und 4,2–4,5 μs für 1H. 4,7 μs für 15 N. Die 1H-13C- und 1H-15N-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, und die Mitte der Rampe entsprach den Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband mit Kontaktzeiten von 0,7–1,5 ms bzw. 1,0–1,7 ms. Für verschiedene Experimente wurden verschiedene 2D-kombinierte R2nν-gesteuerte (CORD)34-Mischzeiten wie 10 ms, 50 ms, 100 ms angewendet, und die 1H-Feldstärke während CORD betrug 14 kHz. Die bandselektive Magnetisierungsübertragung von 15N auf 13C-Kontaktzeit betrug 6,0–6,5 ms. Während der Evolutions- und Erfassungsperioden wurde die SPINAL-6435-Entkopplung (83–95 kHz) verwendet.

MAS-NMR-Experimente wurden auch mit einem 14,1-T-Magnex/Bruker-AVIII-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 3,2-mm-E-Free-HCN-Sonde ausgestattet war. Die Larmorfrequenzen betrugen 599,8 MHz (1H), 150,8 MHz (13C) und 60,7 MHz (15N) bei 14,1 T. Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 2,6–3,0 μs für 1H und 4,0–4,7 μs für 13C und 4,2–4,7 μs für 13C. 4,6 μs für 15 N. Die 1H-13C- und 1H-15N-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, und die Mitte der Rampe entsprach den Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband mit Kontaktzeiten von 1,1–2,0 ms bzw. 1,3–1,8 ms. Für verschiedene Experimente wurden unterschiedliche CORD-Mischzeiten wie 25 ms, 100 ms, 250 ms, 500 ms angewendet und die 1H-Feldstärke während CORD betrug 14 kHz. Die bandselektive 15N-13C SPECIFIC-CP-Kontaktzeit betrug 4,0–6,0 ms. Während der Evolutions- und Erfassungsperioden wurde die SPINAL-6435-Entkopplung (80–86 kHz) verwendet. Für das kristalline Array U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 wurde auch ein 2D-phasenverschobenes 13C-detektiertes protonenunterstütztes Kreuzpolarisationsexperiment mit unempfindlichen Kernen (PAIN-CP)33 erfasst. Während der PAIN-CP-Mischperiode betrugen die Feldstärken für die Kanäle 1H, 15N und 13C alle 60 kHz. Die Länge der PAIN-CP-Mischperiode betrug 4 ms.

Niedertemperatur-MAS-NMR-Experimente von U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 wurden mit einem 17,6 T Bruker AVIII-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 3,2 mm Low-T E-Free HCN-Sonde ausgestattet war. Die MAS-Frequenz betrug 15 kHz und wurde von einem Bruker-MAS-Controller auf ±10 Hz genau gesteuert. Die tatsächliche Probentemperatur wurde für entsprechende Experimente bei –37 ± 1 °C und –79 ± 1 °C gehalten. Die Larmorfrequenzen betrugen 750,1 MHz (1H), 188,6 MHz (13C) und 76,0 MHz (15N) bei 17,6 T. Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 2,5 μs für 1H, 3,1 μs für 13C und 3,3 μs für 15N. Die 1H-13C- und 1H-15N-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 70–100 % auf 1H, und die Mitte der Rampe entsprach den Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband mit Kontaktzeiten von 0,6 ms und 0,9 ms ms bzw. Für verschiedene Experimente wurde eine CORD-Mischzeit von 25 ms angewendet und die 1H-Feldstärke während CORD betrug 15 kHz. Die bandselektive Magnetisierungsübertragung von 15N auf 13C-Kontaktzeit betrug 5,0–6,0 ms. Während der Entwicklungs- und Erfassungsperioden wurde die SWFTPPM-Entkopplung (80 kHz) verwendet.

MAS-NMR-Experimente von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6-, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6-Kristallarrays wurden auf einem 20,0-T-Bruker-AVIII-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 1,9-mm-HCN-Sonde ausgestattet war . Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 3,0–3,1 μs für 1H, 3,9–4,0 μs für 13C und 3,9–4,0 μs für 15N. Die 1H-13C- und 1H-15N-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, wobei die Mitte der Rampe an die Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband angepasst war; Die Kontaktzeiten betrugen 0,3–2,6 ms bzw. 1,4–1,8 ms. Die MAS-Frequenz betrug 40 kHz und wurde von einem Bruker MAS-Controller auf ±10 Hz genau gesteuert. Die tatsächliche Probentemperatur wurde während der Experimente mit dem Bruker-Temperaturregler auf 4 ± 1 °C gehalten. MAS-NMR-Experimente mit doppelter REDOR-Filterung verwendeten gleichzeitige 1H13C/1H15N-REDOR-Dephasierungsperioden von 5 ms, um Signale von 1H zu eliminieren, das direkt an 13C und 15N gebunden ist. Die 1H-13C-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, und die Mitte der Rampe entsprach den Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband mit Kontaktzeiten von 10 ms.

MAS-NMR-Experimente von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/ IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/ IP6-Kristallarrays wurden mit einem 20,0-T-Bruker-AVIII-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 1,9-mm-HX-Sonde ausgestattet war. Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 2,3–3,1 μs für 1H und 3,0–3,3 μs für 13C. Die 1H-13C-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, wobei die Mitte der Rampe an die Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband angepasst war; Die Kontaktzeit betrug 2 ms. Die MAS-Frequenz betrug 40 kHz und 14 kHz und wurde von einem Bruker MAS-Controller auf ± 10 Hz genau gesteuert. Die tatsächliche Probentemperatur wurde mit dem Bruker-Temperaturregler bei 4 ± 1 °C und für einige spezifische Experimente bei –5 ± 1 °C gehalten.

31P-Festkörper-MAS-NMR-Spektren wurden mit einem 20,0-T-Bruker-AVIII-Spektrometer aufgenommen, das mit einer 1,9-mm-HX-Sonde ausgestattet war. Die typischen 90°-Pulslängen betrugen 2,3 μs für 1H und 3,0 μs für 31P. Die 1H-31P-Kreuzpolarisation verwendete eine lineare Amplitudenrampe von 90–110 % auf 1H, und die Mitte der Rampe entsprach den Hartmann-Hahn-Bedingungen am ersten rotierenden Seitenband mit Kontaktzeiten von 3,5 ms und 2,5 ms für Außen- und Außenband CP-Rückübertragungen bzw. Die MAS-Frequenz betrug 40 kHz und wurde von einem Bruker MAS-Controller auf ±10 Hz genau gesteuert. Die tatsächliche Probentemperatur wurde während der Experimente mit dem Bruker-Temperaturregler auf 4 ± 1 °C gehalten.

1D-1H- und 13C-Lösungs-NMR-Spektren von BVM/DMSO-D6 und IP6/D2O wurden mit einem 14,1 T (1H-Larmor-Frequenz von 600,1 MHz) Bruker Avance-Spektrometer unter Verwendung einer Triple-Resonance-Inverse-Detection-Sonde (TXI) gesammelt. 1H-NMR-Spektren von BVM und IP6 sind in den ergänzenden Abbildungen 12 und 15 dargestellt.

Alle MAS-NMR-Daten wurden mit Bruker TopSpin und NMRpipe36 verarbeitet. Die 13C- und 15N-Signale wurden in Bezug auf die externen Standards Adamantan bzw. Ammoniumchlorid referenziert. 1H wurde auf den Wasserpeak bei 4,7 ppm bezogen. 31P wurde im Hinblick auf die Phosphorresonanz von 85 % H3PO4 referenziert. Die 2D- und 3D-Datensätze wurden durch Anwendung einer um 30°, 45°, 60° und 90° verschobenen Sinusglockenapodisierung verarbeitet, gefolgt von einer Lorentz-zu-Gauß-Transformation in beiden Dimensionen. In einigen Datensätzen wurde in der indirekten Dimension eine lineare Vorwärtsvorhersage auf die doppelte Anzahl der ursprünglichen Datenpunkte verwendet, gefolgt von einer Nullfüllung. Die 2D CH HETCOR- und dREDOR-HETCOR-Daten von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-Proben wurden mit Gaußscher Apodisierung und Quadratur-Basislinienkorrektur verarbeitet.

Alle Spektren wurden mit CCPN37 und NMRFAM-Sparky38,39 analysiert. Die Überlagerung der 2D-CORD- und 2D-NCACX-Spektren von U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 und U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4 bei 50 ms zeigen keine signifikanten Unterschiede in der chemischen Verschiebung (ergänzende Abbildung 3). Zuweisungen chemischer Verschiebungen (Intrarest-/sequentielle Zuweisungen) wurden de novo an den CACTD-SP1-Kristallarrays unter Verwendung zahlreicher Festkörper-NMR-Datensätze von U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4 durchgeführt: 2D CORD, 2D und 3D-Dipolar-basiertes NCACX und NCOCX, 3D-CONCA und J-basiertes 2D-Direktverfahren – UNGENÜGEND. Die Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Rückgrat-15N- und Carbonyl-13C-Reste im SP1-Schwanz wurde auf der Grundlage der 2D-NCACX- und NCOCX-Spektren von U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 bei niedrigen Temperaturen (–37 °C und –79 °C) durchgeführt °C). Die De-novo-Zuordnungen der 13C-13C-, 15N-13C-Korrelationen zwischen den Resten wurden für U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 unter Verwendung von 2D-CORD-Spektren (100, 250 und 500 ms Mischzeiten) und 2D-NCACX erhalten (50 ms Mischzeit) und PAIN-CP. Die 13C-1H- und 15N-1H-Interrestkorrelationen wurden unter Verwendung von 1H-detektierten CH- bzw. NH-HETCOR-Spektren erhalten. Auf der Grundlage aller Spektren wurden für 64 Reste alle 13C- und 15N-Rückgrat- und Seitenkettenresonanzen zugeordnet und für 92 Reste wurden vollständige Rückgratzuordnungen erhalten. Für weitere 28 Reste wurden vollständige Rückgrat- und teilweise Seitenkettenzuordnungen erreicht, und 6 weitere Reste wiesen teilweise Rückgrat- und teilweise Seitenkettenzuordnungen auf. Für 4 Reste, P147, R173, V181 und M245 (SP1–M14), sind keine Resonanzzuordnungen verfügbar, da die entsprechenden Peaks entweder aufgrund einer dynamischen Störung fehlten oder sich mit anderen Resonanzen überlappten. Für 84 Reste wurden Amidprotonenzuordnungen (HN) abgeschlossen und für 29 davon wurden auch Rückgratprotonenzuordnungen (HN und Hα) erhalten. Darüber hinaus wurden mehrere chemische Verschiebungen der Seitenkettenprotonen verschiedener Reste eindeutig zugeordnet.

BVM- und IP6-Protonenkorrelationen mit Proteinresonanzen wurden in 2D-HC-CP-HETCOR-, dREDOR-HETCOR- und 2D-(H)PH-HETCOR-Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 und U-13C,15N zugeordnet ,2H-CACTD-SP1/IP6. Alle Proben und ihre Versuchsbedingungen sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die Anzahl der in verschiedenen Spektren für jede Probe zugeordneten Kreuzpeaks ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Chemische Verschiebungen für CACTD-SP1 (kristalline Anordnung) sind in den Ergänzungsdaten 1 zusammengefasst.

Die Anfangskoordinaten des IP6-Moleküls wurden aus der Röntgenstruktur des unreifen HIV-1-CTD-SP1-Hexamers im Komplex mit IP6 (PDB: 6BHR)22 extrahiert, und die Anfangskoordinaten von BVM wurden von ChemSpider erhalten (ID: 403003; 40,41 Beide Carboxylgruppen wurden deprotoniert.

Die anfänglichen Kraftfeldparameter von IP6 wurden analog nach dem CGENFF-Protokoll42 abgeleitet. Die Strafen für abgeleitete IP6-Parameter und -Ladungen lagen alle unter zehn, was auf eine gute Analogie zu den verfügbaren Atomtypen in CGENFF42 hinweist. Daher wurden die IP6-CGENFF-Parameter direkt in Strukturberechnungen verwendet. BVM CHARMM-Kraftfeldparameter (ergänzende Abbildung 16) wurden unter Verwendung von CGenFF abgeleitet. Die Teilladungen und gebundenen Wechselwirkungen von BVM, denen ein Strafwert von mehr als zehn zugewiesen wurde, wurden auf QM-Ebene verfeinert (ergänzende Abbildung 16a). Die Anpassungsbewertung zwischen der QM-Potenzialenergieoberfläche (PES) und den von CGenFF abgeleiteten Molekularmechanikoberflächen (MM) führte ebenfalls zu einem beträchtlich großen quadratischen mittleren Fehler (Root Mean Squared Error, RMSE) (ergänzende Abbildung 16c). Dies bedeutet, dass problematische Parameter geändert werden müssen. Zur Parameteroptimierung wurden das Force Field ToolkitM2.143 (FFTK) in VMD1.9.444 und Gaussian1645 auf den theoretischen Ebenen MP2/6-31 G* und B3LYP/6-31 G* verwendet. Um die Molecular Mechanics Force Field46 (MMFF)-Parameter für das gesamte Molekül zu modifizieren, verwendeten wir den Molekülfragmentierungsansatz42. Zunächst wurde BVM in drei Fragmente (Fragmente 1–3) unterteilt, um die Bereiche mit hoher Strafe zu trennen (ergänzende Abbildung 16b). Eines der Fragmente (Fragment 2) wurde jedoch von CGenFF ohne Strafpunktzahl parametrisiert, wie in der ergänzenden Abbildung 16b gezeigt, und daher haben wir für Fragment 2 den CGenFF-Parameter ohne jegliche Änderung akzeptiert. Kohlenstoffatome an den Schnittpunkten wurden für die Fragmente 1 und 3 mit Methylgruppen abgedeckt. Die Molekülstruktur dieser beiden Fragmente wurde mithilfe von Gaussian 1645 optimiert. Nach der Geometrieoptimierung auf der theoretischen Ebene B3LYP/6-31 G* erfolgte die Parameterverfeinerung in drei Schritten Schritte.

Zunächst wurden die Teilladungen der Atome in BVM basierend auf QM-Daten auf MP2/6-31 G*-Theorieniveau optimiert, um die Wasserstoffbindungswechselwirkungen mit einem Wassermolekül in verschiedenen Orientierungen zu reproduzieren. Für alle Wasserstoffbrückendonoren und -akzeptoren, die eine Wasserstoffbrückenwechselwirkung zwischen einem Wassermolekül und den Atomen der Fragmente enthalten, wird ein Komplex aufgebaut.

Zweitens wurden Gaußsche Berechnungen des Hessischen verwendet, um die Parameter der Bindungslänge und Bindungswinkel mit hohen Strafwerten in jedem Fragment unter Verwendung des skalierten MP2/6-31 G*-Schwingungsspektrums zu optimieren.

Im letzten Schritt wurden Diederwinkelscans durchgeführt, um Oberflächen-PES mit potentieller Energie auf dem theoretischen Niveau B3LYP/6-31 G* zu erzeugen.

Nach Abschluss aller Gaußschen Berechnungen wurden die resultierenden QM-Daten zur Änderung der MMFF-Parameter unter Verwendung von FFTK43 in VMD44 verwendet. Darüber hinaus wurden alle Parameter mithilfe des Downhill-Simplex-Algorithmus47 auf die QM-Zieldaten hin optimiert. Anschließend wurden mehrere Iterationen unter Verwendung der QM-Daten aus den Schritten 1 bis 3 durchgeführt, um Teilladungen, Bindungslängen, Bindungswinkel und Diederwinkel zu modifizieren. Bei jeder Iteration haben wir die MMFF aktualisiert, bis die potentielle Energieoberfläche der Diederwinkel der Molekularen Mechanik (MM) an QM PES mit relativ niedrigem RMSE angepasst ist. Anschließend ergaben die Diederwinkelparameter in jedem Fragment akzeptable Anpassungen an die QM-Potentiale, insbesondere in potenziellen Energiebereichen mit weniger als ~ 10 kcal/mol, wie in der ergänzenden Abbildung 16d – e gezeigt, mit RSME = 0,985 kcal/mol für das Fragment 1 und RMSE = 1,065 kcal/mol für Fragment 3. Die aus QM-Konformationsscans abgeleiteten PESs unterstreichen insbesondere die Genauigkeit des gesamten Parametersatzes, einschließlich Ladungen, Bindungslänge, Bindungswinkel und Diederwinkel42 (Ergänzende Abbildung 16d–e) . Schließlich wurden die drei Fragmente durch Entfernen der Methylgruppen zu einer einzigen BVM-Verbindung zusammengeführt. Die mit der oben erläuterten Methode geänderten Parameter sind in der ergänzenden Abbildung 17 und den ergänzenden Tabellen 2–3 dargestellt.

Die Abstandsbeschränkungen wurden aus zugeordneten Kreuzpeaks in MAS-NMR-Spektren ermittelt. Es wurden sowohl eindeutige als auch mehrdeutige Beschränkungen berücksichtigt; Einschränkungen, die die 5-fache Mehrdeutigkeit überschreiten, wurden jedoch nicht berücksichtigt. Protein-Protein-Beschränkungen waren 13C-13C-, 15N-13C-, 15N-1H- und 13C-1H-Beschränkungen. IP6- und BVM-Beschränkungen waren 1H(IP6, BVM)-13C(Protein)-Beschränkungen und 31P(IP6)-1H(Protein)-Beschränkungen.

Für die CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6-Strukturberechnung wurde die SP1-V7-Position rechnerisch zu einem Alaninrest mutiert. Die WT-Abstandsbeschränkungen zwischen den Resten 13C-13C, 15N-13C und 15N-1H wurden zusammen mit den erhaltenen Abstandsbeschränkungen innerhalb der Reste 13C-13C, 13C-1H, 31P(IP6)-1H(Protein) verwendet aus 2D-CORD-, 2D-HC-HETCOR- und 2D-(H)PH-HETCOR-Spektren von U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6.

Für alle Berechnungen sind die Grenzen der Abstandsbeschränkungen in Tabelle 2 zusammengefasst; Diese wurden auf 1,5–6,5 Å (4,0 ± 2,5 Å) und 2,0–7,2 Å (4,6 ± 2,6 Å) für Intra- bzw. Inter-Rest-Beschränkungen eingestellt, was mit unseren vorherigen Studien übereinstimmt.48 Die Φ- und Ψ-Dieder-Beschränkungen waren vorhergesagt aus TALOS-N49 unter Verwendung der experimentellen chemischen 13C- und 15N-Verschiebungen aus MAS-NMR-Spektren.

Die Einzelkettenstruktur von CACTD-SP1 wurde unter Verwendung des MAS-NMR-Abstands und der Diederbeschränkungen unter Verwendung von Xplor-NIH Version 2.5350,51,52 berechnet. Faltungsberechnungen wurden anhand von Primärsequenz-erweiterten Strängen durchgeführt. Eintausend Strukturen wurden mittels molekulardynamisch simuliertem Tempern im Torsionswinkelraum mit zwei aufeinanderfolgenden Temperplänen und einer abschließenden Gradientenminimierung im kartesischen Raum berechnet. Die Strukturberechnung begann mit einem Molekulardynamiklauf bei konstanter Temperatur bei 3500 K für die kürzere Zeit von 800 ps oder 8000 Schritten, wobei die Zeitschrittgröße innerhalb einer Toleranz schwankte, um eine konstante Energie aufrechtzuerhalten. Die anfänglichen Geschwindigkeiten wurden anhand einer Maxwell-Verteilung unter Verwendung einer Starttemperatur von 3500 K randomisiert. Im Anschluss an diese anfängliche Molekulardynamikberechnung wurde eine simulierte Glühberechnung durchgeführt, bei der die Temperatur in Schritten von 25 K auf 100 K reduziert wurde. Bei jeder Temperatur wurde die Dynamik gemessen Laufen Sie mit der kürzeren Geschwindigkeit von 0,4 ps oder 200 Schritten. Die Kraftkonstanten für Abstandsbeschränkungen wurden von 10 auf 50 kcal mol−1 Å−2 erhöht. Die Beschränkungen des Diederwinkels waren für die Hochtemperaturdynamik bei 3500 K deaktiviert, wurden jedoch während des simulierten Temperns mit einer Kraftkonstante von 200 kcal mol−1 rad−2 aktiviert. Die Gyrationsvolumenkraftkonstante53 wurde geometrisch von 0,002 auf 1 skaliert. Die Torsionswinkeldatenbank54 und HBPot55 wurden ebenfalls verwendet. Nach dem simulierten Tempern wurden die Strukturen mithilfe eines Powell-Energieminimierungsschemas minimiert.

Anschließend wurden die 10 Strukturen mit der niedrigsten Energie zur weiteren Verfeinerung ausgewählt, wobei insgesamt 1000 Strukturen verfeinert wurden. Das Tempern wurde bei 3000 K für 10 ps oder 5000 Schritte durchgeführt, je nachdem, was zuerst abgeschlossen wurde. Der Startzeitschritt betrug 1 fs und wurde in nachfolgenden Schritten selbst angepasst, um die Energieeinsparung sicherzustellen. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden anhand einer Maxwell-Verteilung unter Verwendung der Starttemperatur von 3000 K randomisiert. Die Temperatur wurde anschließend in Schritten von 12,5 K auf 25 K reduziert. Bei jeder Temperatur betrug der anfängliche Standardzeitschritt 1 fs und ein Dynamiklauf von 0,2 ps wurde durchgeführt. Die Kraftkonstanten für Abstandsbeschränkungen wurden von 2 auf 30 kcal mol−1 Å−2 erhöht. Die Dieder-Rückhaltekraftkonstanten wurden für die Hochtemperaturdynamik bei 3000 K auf 10 kcal mol−1 rad−2 und während des Abkühlens auf 200 kcal mol−1 rad−2 eingestellt. Die Gyrationsvolumenkraftkonstante53 wurde von 0,002 auf 1 skaliert. Die Torsionswinkeldatenbank54 und HBPot55 wurden ebenfalls verwendet. Die getemperten Strukturen wurden mithilfe eines Powell-Energieminimierungsschemas minimiert.

Die wie oben beschrieben berechnete Einzelkettenstruktur mit der niedrigsten Energie wurde einem Starrkörper-Andocken in die Hülle des Hexamers von Hexameren unterzogen. Das Andocken wurde mithilfe eines hauseigenen UCSF-Chimera56-Skripts durchgeführt (siehe Ergänzende Anmerkung 1). Insbesondere wurden in der Karte auf der Grundlage der niedrigsten Kreuzkorrelationswerte und einer kurzen visuellen Inspektion 42 beste Positionen (aus 7 Hexamer-Einheiten) für das Andocken von Einzelkettenstrukturen identifiziert. Vor dem Andocken wurde die Dichte mithilfe der „Molmap“-Routine in UCSF Chimera erstellt.

Nach dem Andocken wurde eine Berechnung durchgeführt, um die genaue Position der IP6- und BVM-Liganden zu ermitteln und zusätzliche Abstandsbeschränkungen zwischen Ketten und Hexamereinheiten zu berücksichtigen. Die Berechnung erfolgte anhand der Einzelketten-CACTD-SP1-Koordinaten, die aus den experimentellen MAS-NMR-Beschränkungen (siehe oben) berechnet wurden, zusammen mit den Koordinaten von BVM und/oder IP6, die wie oben beschrieben generiert wurden. Die Platzierung der Moleküle innerhalb eines einzelnen Hexamers wurde durch visuelle Inspektion abgeschätzt, um eine ordnungsgemäße Anwendung der Protein-Ligand-Abstandsbeschränkungen zu ermöglichen. Die Koordinaten wurden mithilfe des Befehls symexp in PyMol57 von einem einzelnen Hexamer auf eine Hexamer-aus-Hexamer-Einheit mit 7 Hexameren (42 Ketten) erweitert.

100 Strukturen wurden einer Torsionswinkeldynamik mit einem Glühplan und einer abschließenden Gradientenminimierung im kartesischen Raum unterzogen. Die Kraftfeldparametrisierung der IP6- und BVM-Moleküle wurde über Topologie- und Parameterdateien, die speziell für Xplor-NIH erstellt wurden, in den Lauf integriert. Die BVM- und IP6-Moleküle konnten sich während der Dynamik und der endgültigen Minimierung frei als starre Körper bewegen. Zwei identische Läufe simulierten Temperns, beginnend bei 3000 K, wurden für 10 ps mit einem Zeitschritt von 1 fs durchgeführt. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden randomisiert, um eine Maxwell-Verteilung bei einer Starttemperatur von 3000 K zu erreichen. Anschließend wurde die Temperatur in Schritten von 25 K auf 25 K reduziert. Bei jedem Temperaturschritt wurde die Dynamik für 400 fs mit einem anfänglichen Zeitschritt von 1 durchgeführt fs.

Standardbegriffe für Bindungslängen, Bindungswinkel und unechte Winkel wurden verwendet, um die richtige kovalente Geometrie durchzusetzen. Standardpotentiale wurden verwendet, um Abstands- und Diederbeschränkungen einzubeziehen.

Ein Kreuzkorrelations-Wahrscheinlichkeitsverteilungspotential, das häufig für experimentelle Kryo-EM-Dichte58 verwendet wird, verstärkte/ermöglichte die Gesamtform und Grenze des Hexamers von Hexameren mit der 8-Å-Dichtekarte, die zuvor zum Andocken verwendet wurde. Das Potenzial wurde auf Rückgratatome (N, C, CA und O) beschränkt, um sicherzustellen, dass die Dichtegrenze die Seitenkettenkonformationen nicht beeinflusst.

Es wurde ein statistisches Torsionswinkelpotential54 verwendet und der Gyrationsvolumenterm wurde nicht einbezogen, um Konflikte mit dem Kreuzkorrelationsdichtepotential zu vermeiden. Zur Verbesserung der Wasserstoffbrückengeometrien wurde der Begriff HBPot aus der Datenbank für Wasserstoffbrückenbindungen verwendet55. Mithilfe des PosDiffPot-Terms von Xplor-NIH wurde eine annähernde nichtkristallographische Symmetrie eingeführt, die es ermöglicht, dass sich die Untereinheiten des Hexamers um bis zu 1 Å unterscheiden.

Die Kraftkonstanten für Abstandsbeschränkungen wurden von 2 auf 30 kcal/mol·Å2 erhöht. Die Dieder-Rückhaltekraftkonstanten wurden für Hochtemperaturdynamik bei 3000 K auf 10 kcal/mol·rad2 und während des Abkühlens auf 200 kcal/mol·rad2 eingestellt. Die Kraftkonstanten des Kreuzkorrelationswahrscheinlichkeitsverteilungspotentials wurden während der Hochtemperaturdynamik und Abkühlung auf 50 kcal/mol eingestellt.

Nach der Hochtemperaturdynamik und Abkühlung im Diederraum wurden die getemperten Strukturen mithilfe eines Powell-Energieminimierungsschemas im kartesischen Raum minimiert. Das endgültige MAS-NMR-Bündel umfasste die fünf energieärmsten der 100 berechneten Strukturen.

RMSD-Werte wurden mithilfe von Routinen im Xplor-NIH (Version 2.51)50,51,52 berechnet. Die Visualisierungen der Strukturelemente wurden in PyMOL mit hauseigenen Shell/Bash-Skripten stapelweise gerendert. Sekundärstrukturelemente wurden nach TALOS-N klassifiziert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die MAS-NMR-Atomstrukturkoordinaten wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 7R7P (einzelnes Hexamer von CACTD-SP1/BVM/IP6) und 7R7Q (einzelnes Hexamer von CACTD-SP1/IP6) hinterlegt. Chemische MAS-NMR-Verschiebungen wurden in der Biological Magnetic Resonance Data Bank unter den Zugangscodes BMRB 30929 (CACTD-SP1/BVM/IP6) und BMRB 30930 (CACTD-SP1/IP6) hinterlegt. Die in dieser Studie verwendete Hülle aus Hexamer-von-Hexameren von CACTD-SP1 ist in der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 5I4T verfügbar. Die ursprünglichen Koordinaten der in dieser Studie verwendeten IP6-Struktur sind in der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 6BHR verfügbar. Quelldaten für virale Infektiositätstests werden in diesem Dokument bereitgestellt. Weitere Daten, die die Ergebnisse der Studie unterstützen, beispielsweise Skripte für Strukturberechnungen, Analyse von Berechnungsergebnissen und Strukturvisualisierungen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Das UCSF-Chimera-Skript zum Batch-Andocken der MAS-NMR-Struktur ist in den Zusatzinformationen verfügbar.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health-Zuschüsse P50 AI1504817 (AMG und TP), 1U54 AI170791 (AMG, TP, BKG-P. und JRP), R01 AI129678 (BKG-P. und OP), P20 GM104316 und R01 AI157843 unterstützt (JRP). Wir danken der National Science Foundation (NSF Grant CHE0959496) für die Anschaffung des 850-MHz-NMR-Spektrometers und den National Institutes of Health (NIH Grant P30 GM110758) für die Unterstützung der Kerninstrumenteninfrastruktur an der University of Delaware; und der National Institutes of Health (NIH Grant S10 OD012213) für den Erwerb des 750-MHz-NMR-Spektrometers an der University of Pittsburgh. Wir danken für die Ressourcen des DARWIN-Supercomputers an der University of Delaware.

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Delaware, Newark, DE, 19716, USA

Sucharita Sarkar, Roman Zadorozhnyi, Ryan W. Russell, Caitlin M. Quinn, Hamed Meshkin, Juan R. Perilla, Angela M. Gronenborn und Tatyana Polenova

Pittsburgh Center for HIV Protein Interactions, University of Pittsburgh School of Medicine, 1051 Biomedical Science Tower 3, 3501 Fifth Ave., Pittsburgh, PA, 15261, USA

Sucharita Sarkar, Roman Zadorozhnyi, Ryan W. Russell, Juan R. Perilla, Angela M. Gronenborn und Tatyana Polenova

Abteilung für Molekulare Physiologie und biologische Physik, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA, 22908, USA

Kaneil K. Zadrozny, Barbie K. Ganser-Pornillos & Owen Pornillos

HIV Dynamics and Replication Program, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, Frederick, MD, 21702-1201, USA

Alex Kleinpeter, Sherimay Ablan und Eric O. Freed

Abteilung für Strukturbiologie, University of Pittsburgh School of Medicine, 3501 Fifth Ave., Pittsburgh, PA, 15261, USA

Angela M. Gronenborn & Tatyana Polenova

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TP, AMG, BKG-P. und OP konzipierten das Projekt und leiteten die Arbeit. SS und RZ führten NMR-Experimente durch und analysierten die experimentellen Daten. KKZ hat die Proben vorbereitet. RWR und SS führten die Strukturberechnungen durch. JRP entwarf und leitete die MD-Simulationen. HM und JRP parametrisierten die Kraftfelder für BVM. SS, RWR, RZ, HM und KKZ erstellten Abbildungen für das Manuskript. RWR schrieb Skripte für Strukturberechnungen, Analyse von Berechnungsergebnissen und Strukturvisualisierungen. CMQ war an der Gestaltung oder Analyse von NMR-Experimenten beteiligt. EOF lieferte A1V- und V7A-Virussequenzpolymorphe und kritisches Feedback zur Datenanalyse. AK und SA führten Studien zur Infektiosität und BVM-Bindung von BVM-resistenten Varianten durch. TP, AMG, BKG-P. und OP übernahmen die Federführung bei der Erstellung des Manuskripts. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zur Manuskripterstellung bei.

Korrespondenz mit Barbie K. Ganser-Pornillos, Owen Pornillos, Angela M. Gronenborn oder Tatyana Polenova.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Ann McDermott und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sarkar, S., Zadrozny, KK, Zadorozhnyi, R. et al. Strukturelle Grundlagen der Bindung und Aktivität des HIV-1-Reifungsinhibitors. Nat Commun 14, 1237 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36569-y

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Eingegangen: 05. Juni 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 04. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36569-y

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