Genomische und phänotypische Charakterisierung von Acinetobacter colistiniresistens, isoliert aus dem Kot eines gesunden Mitglieds der Gemeinschaft

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12596 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Acinetobacter-Arten sind weithin bekannte opportunistische Krankheitserreger, die schwere Infektionen in der Bevölkerung und im Gesundheitswesen verursachen. Von einem dieser neu auftretenden Krankheitserreger, Acinetobacter colistiniresistens, ist bekannt, dass er eine intrinsische Resistenz gegen Colistin aufweist. Im Rahmen einer Kohortenstudie in Segamat, Malaysia, untersuchten wir die molekularen Eigenschaften des A. colistiniresistens-Stammes C-214, der aus der Stuhlprobe eines gesunden Gemeindemitglieds isoliert wurde. Der Vergleich der gesamten Genomsequenz von C-214 mit anderen A. colistiniresistens-Sequenzen aus der NCBI-Datenbank ergab eine Sequenzidentität von 95 % oder mehr mit vielen der Genomsequenzen, die diese Art repräsentieren. Die Verwendung des Galleria mellonella-Abtötungstests zeigte, dass C-214 in diesem Modellinfektionssystem pathogen war. Der Stamm C-214 hatte eine Colistin- und Polymyxin-B-MHK von 32 bzw. 16 mg/L. Außerdem war es resistent gegen Cefotaxim, Amikacin und Tetracyclin und zeigte eine mäßige Fähigkeit zur Biofilmproduktion. Es wurden verschiedene Gene entdeckt, die mit Virulenz oder Resistenz gegenüber wichtigen Antibiotikaklassen assoziiert sind. Wir haben Mutationen in lpxA/C/D in C-214 und anderen A. colistiniresistens-Stämmen als wahrscheinliche Ursachen der Colistin-Resistenz beobachtet, aber die biologischen Auswirkungen dieser Mutationen erfordern weitere Untersuchungen. Diese Studie liefert genomische Einblicke in A. colistiniresistens, ein potenziell pathogenes Bakterium, das aus einem Gemeinschaftsmitglied isoliert wurde, und weist auf die Gefahr hin, die es für die öffentliche Gesundheit darstellen kann.

Die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien hat im Laufe der Zeit stark zugenommen und stellt ein erhebliches Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. Der Missbrauch von Antibiotika in der Human- und Veterinärmedizin, der Landwirtschaft und der Geflügelproduktion trägt zur Entstehung antibiotikaresistenter Mikroorganismen bei. Multiresistente Bakterien kommen nicht nur häufig in Gesundheitseinrichtungen vor, sondern werden auch zunehmend in der Gemeinde und in Umweltquellen in der Umgebung identifiziert1,2,3.

Unter den antibiotikaresistenten Bakterien sind Acinetobacter spp. haben sich als opportunistische Krankheitserreger herausgestellt, die häufig mit therapieassoziierten Infektionen in Zusammenhang stehen4,5. Allerdings wurden verschiedene Arten von Acinetobacter aus unterschiedlichen Quellen isoliert. Obwohl A. baumannii klinisch und epidemiologisch eindeutig die wichtigste Acinetobacter-Art ist, wurden auch andere Acinetobacter-Arten mit Infektionen beim Menschen in Verbindung gebracht und als antibiotikaresistent befunden und können sich unter Krankenhauspatienten ausbreiten6,7,8. Eine Studie von Touchon et al.9 ergab, dass die Gattung Acinetobacter aus Isolaten besteht, deren Kern-DNA-Sequenzen überraschend variabel sind, und sie identifizierten eine Klade, die Mitglieder mit proteolytischer oder hämolytischer Aktivität enthält. Sieben dieser Mitglieder wurden als Arten und sechs weitere als genomische Arten benannt, darunter eines mit der Bezeichnung 13BJ/14TU9. Nemec et al.10 untersuchten den taxonomischen Status von 40 Acinetobacter-Isolaten und benannten weitere fünf Arten. Im Jahr 2017 untersuchten Nemec et al.11 die Genomspezies 13BJ/14TU und fanden 24 Stämme mit charakteristischen rpoB/gyrB-Sequenzen. Diese Sequenzen wurden alle von Patienten isoliert und wiesen ein hohes Maß an Colistin (Polymyxin E)-Resistenz auf, die bei keiner anderen Spezies innerhalb der hämolytischen/proteolytischen Gruppe beobachtet wird6,12. Aufgrund der intrinsischen Resistenz gegen Colistin benannten Nemec et al.11 das 13BJ/14TU-Genomsequenzisolat in Acinetobacter colistiniresistens um. Die Genomassemblierung des 13BJ/14TU-Isolats ist unter GCF_003227755.1 verfügbar.

Bei der Gattung Acinetobacter handelt es sich um streng aerobe, gramnegative Kokkobazillen mit Oxidase-negativen und Katalase-positiven Eigenschaften11. Bisher wurde die Art A. colistiniresistens nur aus klinischen Proben isoliert, darunter Sputum5, Haut, Blut13, Vagina, Auge, Wundabstrich, Katheter, Bindehaut und Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit11. Sein Vorkommen ist typischerweise mit schweren Krankheiten wie Septikämie verbunden14,15. Der A. colistiniresistens-Typstamm NIPH 2036T (Genomassemblierung GCF_000413935.1) wurde vor 1990 aus einem Katheter in Belgien isoliert13. Es gibt keine Hinweise auf eine Charakterisierung dieser Art anhand von Umweltnischen, Tieren oder gesunden Individuen.

Das Auftreten und die Verbreitung multiresistenter (MDR) Acinetobacter spp. hat zur Wiedereinführung des Polymyxin-Antibiotikums Colistin als Erstlinientherapie für solche Infektionen geführt12,16. Infolgedessen ist weltweit, auch in Malaysia, eine Colistin-Resistenz bei Acinetobacter und anderen Bakterien aufgetreten, was die Möglichkeiten zur Behandlung von MDR-Erregern einschränkt. Bei A. baumannii wurden zwei Mechanismen der Colistin-Resistenz beschrieben: (1) Der Zusatz von Phosphoethanolamin zum Lipid-A-Teil des Lipopolysaccharids (LPS), der durch Mutationen in den Genen verursacht wird, die für die Signalproteine PmrA und PmrB kodieren, und (2 ) der Verlust der LPS-Produktion, der durch Mutationen in den Genen lpxA, lpxC und lpxD verursacht wird17. Es liegen jedoch keine detaillierten Studien zur Colistinresistenz bei A. colistiniresistens-Stämmen vor. Darüber hinaus wurde noch keine Virulenzstudie zu A. colistiniresistens veröffentlicht.

Angesichts der wachsenden klinischen Bedeutung von A. colistiniresistens und seiner erhöhten Antibiotikaresistenz ist das Verständnis seiner potenziellen Reservoire und Expositionswege zu einem dringenden Anliegen geworden. Die Übertragung und die genotypischen Eigenschaften von A. colistiniresistens innerhalb der Gemeinschaft sind jedoch nach wie vor kaum verstanden. Hier berichten wir über die Charakterisierung eines A. colistiniresistens, der aus dem Kot eines gesunden Individuums isoliert wurde. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie über A. colistiniresistens, die aus der Gemeinschaft isoliert wurde. Wir haben den isolierten A. colistiniresistens-Stamm phänotypisch und genotypisch charakterisiert und eine vergleichende Gesamtgenomsequenzanalyse mit anderen von NCBI kuratierten A. colistiniresistens-Stämmen durchgeführt. Die Larven der Wachsmotte Galleria mellonella, ein relativ einfaches, nicht von Säugetieren stammendes Modell, wurden verwendet, um die Pathogenität des A. colistiniresistens-Stammes zu untersuchen18. Die aus dieser Studie generierten Daten liefern Einblicke in die genetische Vielfalt innerhalb der A. colistiniresistens-Stämme und verdeutlichen deren potenzielle Bedrohung für die Gemeinschaft.

Die Studie wurde von der Ethikkommission/IRB der Monash University Human Research Ethics Committee (MUHREC, Projektnummer: 1516) genehmigt, was im Einklang mit der WMA-Erklärung von Helsinki (WMA und World Medical Association 2013) steht. Von jedem an der Studie beteiligten Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Darüber hinaus wurde diese Studie in Zusammenarbeit mit dem Southeast Asia Community Observatory (SEACO) mit Sitz im Segamat-Distrikt des südlichen Bundesstaates Johor auf der malaysischen Halbinsel durchgeführt.

Ein einzelnes Colistin-resistentes Acinetobacter-Isolat wurde nach dem Screening von 233 Stuhlproben von Segamat im Jahr 2018 auf Bakterien- und Pilzisolate erhalten. Das Isolat war Teil einer größeren Kohorte von Acinetobacter spp. Isolate, die im Rahmen eines Gemeinschaftsforschungsprojekts identifiziert wurden, bei dem es um die Isolierung und Untersuchung von ESKAPE-Krankheitserregern bei im Segamat-Distrikt lebenden Personen ging19.

Die Schritte zur Probenentnahme und -verarbeitung wurden bereits früher beschrieben20. Die Proben wurden auf Leeds Acinetobacter Agar (HiMedia, Indien) und MacConkey Agar (Oxoid, UK) ausplattiert und anschließend 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Koloniemorphologie und die Art der Stämme wurden beobachtet und aufgezeichnet. Aus jeder Probe wurden drei Kolonien mit Acinetobacter-Morphologie ausgewählt und durch biochemische Standardmethoden (Gramfärbung, Katalase-Test und Oxidase-Reaktionen) identifiziert.

Zur Bestätigung der Acinetobacter spp. wurde eine PCR-Amplifikation eines 16S-rRNA-Genfragments und eine anschließende Sequenzierung durchgeführt. Das 16S-rRNA-Gen wurde mithilfe der in früheren Studien beschriebenen Universalprimer gezielt21. Die bakterielle DNA-Extraktion für die PCR wurde mit der von Dashti et al.22 beschriebenen Kochextraktionsmethode durchgeführt.

Tests und Interpretation der antimikrobiellen Empfindlichkeit wurden unter Verwendung der Standard-Scheibendiffusionsmethode für 12 verschiedene Antibiotika auf Mueller-Hinton-Agar (Oxoid, UK) gemäß den Richtlinien des Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)23 durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Antibiotika-Plättchen waren Piperacillin, Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim, Cefepim, Aztreonam, Imipenem, Meropenem, Gentamicin, Amikacin, Ciprofloxacin und Tetracyclin.

Für Colistin und Polymyxin B wurde jedoch die Mikroverdünnung der Brühe verwendet, die einzige Methode, die CLSI empfiehlt. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Colistin und Polymyxin B wurde gemäß den CLSI-Richtlinien von 2015 ermittelt und hat Grenzwerte beobachtet (≤ 2 mg/L, anfällig; > 4 mg/L, resistent). Als Kontrollen wurden Acinetobacter baumannii ATCC BAA 1605 und E. coli ATCC 2325 mit bekannten Antibiotikaresistenzmustern verwendet.

Biofilmproduktions- und Quantifizierungstests wurden gemäß Huet et al.20 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, wurden jeder Vertiefung insgesamt 100 μl Trypton-Soja-Bouillon (TSB)-Medium (Oxoid, UK), ergänzt mit 0,2 % Glucose, zugesetzt. Unter Verwendung einer Bakterienkultur über Nacht wurde die Zellsuspension auf 0,5 McFarland-Standard in TSB, ergänzt mit 0,2 % Glucose, eingestellt und 100 μl jeder Suspension wurden in jede Vertiefung geimpft. Zwei Vertiefungen wurden nicht beimpft und als Negativkontrollen verwendet. Zur Biofilmproduktion wurden die Platten 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss an den Biofilmproduktionstest wurde die Biofilmquantifizierung mithilfe von Kristallviolett- (CV) und XTT-Tests durchgeführt.

Um die vollständige Genomsequenzierung zu erreichen, wurde eine hybride Kurz- und Long-Read-basierte Gesamtgenomsequenzierung (WGS) durchgeführt. Die gesamte genomische DNA wurde nach Sambrook & Russell24 mithilfe der Phenol-Chloroform-Phasentrennungsmethode extrahiert. Die Qualität und Konzentration der extrahierten DNA wurde mit einem Nanodrop-Bioanalysator-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Delaware, USA) bewertet.

Die Short-Read-Sequenzierungsdaten wurden mit einem Nextera XT-Bibliotheksvorbereitungskit (Illumina, San Diego, CA, USA) generiert und die Sequenzierung wurde mit einem Illumina MiSeq-Sequenzierer mit dem MiSeq Reagent Kit v3 gemäß dem Protokoll des Herstellers (2 × 250 bp) durchgeführt Paired-End-Leseeinstellung). Zusätzlich wurden für die Long-Read-Sequenzierung DNA-Bibliotheken gemäß dem Ligation Sequencing Kit-Protokoll (SQK-LSK109) erstellt. Die Long-Read-Sequenzierungsdaten wurden dann mit einer MinION FLO-MIN106-Durchflusszelle und einem MinION MK1B-Sequenzierungsgerät (Oxford Nanopore Technology) generiert.

Qualitätstrimmen und Filtern der rohen MiSeq-Shortreads wurden mit Trimmomatic – Version 0.39 mit den Parametern PE, ILLUMINACLIP: adapters/NexteraPE.fa:2:30:10:8, LEADING:3, TRAILING:3, SLIDINGWINDOW:5 durchgeführt :20, MINLEN:35 (Bolger et al.25). Das Short-Read-Draft-Genom wurde de novo mit SPAdes 3.13.026 zusammengesetzt. Für den langen Lesevorgang wurde Base-Calling mit Guppy v3.2.10 bis MinKnow v3.6.17 durchgeführt, wobei die schnelle Base-Calling-Konfiguration verwendet wurde. Die Long-Read-Genomassemblierung wurde mit Flye v2.727 durchgeführt und die Sequenz wurde später mit den getrimmten Short-Reads mit Pilon v1.2328 korrigiert und verfeinert. Die Qualität der korrigierten Baugruppe wurde mit BUSCO v4.0.629 bewertet. Die funktionale Annotation wurde mit Prokka 1.1330 durchgeführt und die Genomkarte wurde mit BLAST Ring Image Generator (BRIG) v0.9531 aufgezeichnet. Plasmide wurden mit Plasmid Seeker32 nachgewiesen.

Die Artenidentifizierung erfolgte über die durchschnittliche Nukleotididentität (ANI) auf Basis von BLAST und die In-silico-DNA-DNA-Hybridisierung (isDDH) unter Verwendung des Online-Server-Tools JSpeciesWS33 bzw. des Genom-zu-Genom-Abstandsrechners34 mit Standardparametern. Als Grenzwert zur genauen Definition der Bakterienart wurden ein ANI-Wert von mehr als 95 % und isDDH-Werte ≥ 70,0 % herangezogen. Eine phylogenomische Analyse eng verwandter Acinetobacter spp. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde mit dem GToTree-Programm v.1.7.0535 durchgeführt. Diese Sequenzen wurden vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) abgerufen, basierend auf dem Vorhandensein von Einzelkopie-Genen in jedem Genom, einschließlich unseres Isolats C-214.

Eine vergleichende Genomanalyse wurde zwischen unserem Stamm C-214 und den Genomsequenzen von 20 anderen A. colistiniresistens-Stämmen durchgeführt, die von NCBI erhalten wurden (GCF_000248195.1, GCF_000369645.1, GCF_000369765.1, GCF_000413935.1, GCF_000876115.1, GCF_00). 3227755. 1, GCF_003569565.2, GCF_007713425.1, GCF_008982465.1, GCF_008984005.1, GCF_008987005.1, GCF_008988385.1, GCF_008990765.1, GCF_008992365.1 , GCF_008993755.1, GCF_009013055.1, GCF_009013115.1, GCF_009013295.1 und GCF_900406805.1). Zwei A. baumannii-Stämme (H-10112 und C-98), die während der Studie am selben Ort gesammelt wurden, wurden verwendet, um die Sequenzvariation mit A. colistiniresistens-Stämmen zu vergleichen. Der Stamm H-10112 war ein MDR-Krankenhausstamm und C-98 war ein Nicht-MDR-Gemeinschaftsstamm36.

Die umfassende Antibiotikaresistenzdatenbank (CARD)37 wurde verwendet, um erworbene Antibiotikaresistenzgene mit Abricate Version 1.0.1 (https://github.com/tseemann/abricate) zu identifizieren. Virulenzassoziierte Gene wurden mithilfe der Virulenzfaktordatenbank (VFDB4)38 identifiziert. Mobile genetische Elemente wurden mit ISFinder39 erkannt. Geninhaltsmatrizen wurden mit anvi'o40 erhalten.

Im Genom des C214-Isolats wurde ein ampC-Gen nachgewiesen. Es ähnelt dem UniRef90_N9PW73-Cluster (UniRef50_A0A0N1I997-Cluster bei 50 % Cutoff), dessen Proteinsequenzen ausschließlich zu A. colistiniresistens gehörten. Die AmpC-Proteinsequenz von C214 wurde zusammen mit Proteinsequenzen des UniRef50_A0A0N1I997-Clusters und Ambler-Klasse-C-Beta-Lactamasen aus der BLDB-Datenbank41 zusammengestellt, um mithilfe von FastTree42 einen phylogenetischen Baum zu erstellen. Der ampC-Genbaum wurde mit iTol v643 visualisiert.

Um die virulente Natur von A. colistiniresistens zu bestimmen, wurde ein In-vivo-Abtötungstest an der Wachsmotte Galleria mellonella durchgeführt. Die G. mellonella-Larven wurden von Carolina Biological, USA, gekauft. Larven, die Symptome einer Melanisierung oder Verformung zeigten, wurden aus dem Test ausgeschlossen, um die Möglichkeit einer Verzerrung auszuschließen. Jede Larve wurde gewogen und diejenigen, die die Kriterien von 250 ± 50 mg erfüllten, wurden in der Studie verwendet. Abtötungsassay-Experimente wurden durchgeführt, indem 10 µl zweier verschiedener Bakterienlösungen mit 107 bzw. 106 koloniebildenden Einheiten pro Larve (KBE/Larve) mit einer Hamilton-Spritze in das letzte linke Proleg injiziert wurden. Um den Tod durch physische Schäden zu überprüfen, wurden einer Gruppe von Larven 10 µl PBS als Negativkontrolle injiziert. Eine andere Kontrollgruppe erhielt keine Injektion. Die Larven wurden sieben Tage lang bei 37 °C inkubiert und alle 24 Stunden auf Todessymptome untersucht. Larven, die nicht auf taktile Reize reagierten oder eine schwärzliche Verfärbung aufwiesen, wurden als tot gemeldet. A. baumannii C-98 und E. coli OP50 wurden als Referenzstämme mit hoher bzw. niedriger Pathogenität ausgewählt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt, wobei der Durchschnittswert berücksichtigt wurde.

Alle Analysen wurden in drei separaten Experimenten mit der GraphPad Prism-Software 6.01 durchgeführt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde bei p ≤ 0,05 bestimmt. Die Abtötung von G. mellonella durch A. colistiniresistens wurde mit der Kaplan-Meier-Methode analysiert. Es wurde ein Log-Rank-Test durchgeführt.

Eine Untersuchung von A. baumannii aus Stuhlproben aus der Gemeinde im Bezirk Segamat, Johor, Malaysia, führte zur Isolierung einer einzelnen Colistin-resistenten Acinetobacter spp. bezeichnet als C-214, auf selektiven Agarplatten. Der Träger war eine 34-jährige Hausfrau aus der indigenen Orang Asli Jakun-Gemeinschaft.

Zur vorläufigen Artenidentifizierung wurde eine PCR mit den Universalprimern 27F und 1492R durchgeführt, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung, um die nahezu vollständige 16S-rRNA-Gensequenz des Stamms zu erhalten36. Die Verwendung von BLAST für die 16S-rRNA-Sequenz gegen die NCBI-Datenbank ergab, dass das Isolat zur Gattung Acinetobacter gehörte und ein Mitglied der Art Colistiniresistens ist.

Es wurde eine FE-SEM-Bildgebung durchgeführt und die Koloniemorphologie verglichen, um etwaige Unterschiede in der Bakterienzellmorphologie zwischen A. baumannii und A. colistiniresistens zu untersuchen. Es wurde kein signifikanter Unterschied in ihrer Zellmembran und Koloniebildung beobachtet. Es wurde festgestellt, dass beide Coccobacillus-Phänotypen aufwiesen. Auf selektiven Leeds Acinetobacter-Agarmedien produzierten sie identische Kolonien und Farben (Daten nicht gezeigt).

Das Isolat C-214 hatte eine Colistin- und Polymyxin-B-MIC von 32 bzw. 8 µg/ml (Tabelle 1). Zusätzlich zur Colistin-Resistenz war dieses Isolat phänotypisch resistent gegen Cefotaxim, Amikacin und Tetracyclin, aber empfindlich gegenüber Cefepim, Ceftazidim, Ciprofloxacin, Gentamicin, Piperacillin/Tazobactam und Carbapenemen, basierend auf dem Scheibendiffusions-Antibiotika-Empfindlichkeitstest (Tabelle 1).

Die Fähigkeit von C-214 zur Biofilmbildung wurde ebenfalls bewertet. Basierend auf XTT- und CV-Assays zeigte das Isolat C-214 eine mäßige Fähigkeit zur Biofilmbildung (Tabelle 1).

C-214 wurde sowohl mit Short-Read- (Illumina MiSeq) als auch mit Long-Read-Sequenzierungstechnologien (Oxford Nanopore) sequenziert. Die Hybridgenomassemblierung ergab, dass der Acinetobacter-Stamm C-214 ein kreisförmiges Chromosom von 3.865.171 bp (GC-Gehalt 41,33 %) enthielt (Abb. 1). Der GC-Gehalt ist fast identisch mit dem, der für die durch GCF_003227755.1 dargestellte Sequenz von A. colistiniresistens berichtet wurde, und die Genomgröße ist typisch für diesen Stamm. Außerdem wurden drei zirkuläre Plasmide mit Größen von 10.411 bp (p214-1), 5509 bp (p214-2), 8305 bp (p214-3) und einem GC-Gehalt von 35,4, 30,79 bzw. 33,65 % nachgewiesen (Ergänzung B). . Die durchschnittliche Genomgröße ähnelt der von A. baumannii, dessen Genome zwischen 3,6 und 4 Mbp groß sind und einen GC-Gehalt von etwa 39 % aufweisen44,45.

Genomkarte des Acinetobacter colistiniresistens-Stamms C-214-Chromosoms (CP102099), aufgezeichnet mit dem BLAST-Ringbildgenerator (BRIG). Der äußere farbige Kreis bezeichnet den GC-Versatz der Genomsequenzen (lila: negativ; grün: positiv), gefolgt von der Verteilung antimikrobieller Resistenzgene (rot), Virulenzgenen (blau) und CRISPR-Cas-System-Loci (grau).

Die Genom-Annotationsanalyse mit Prokka erkannte 3844 Gene mit 3.705 kodierenden Sequenzen, 75 tRNA-Sequenzen, 18 rRNA-Sequenzen, 1 tmRNA-Sequenz und 45 verschiedenen RNA-Sequenzen.

ANI- und In-silico-DNA-DNA-Hybridisierungsanalysen des Stamms C-214 wurden gegen 79 verschiedene Acinetobacter spp. zusammen mit 19 A. colistiniresistens-Stämmen durchgeführt (Ergänzung B). Die höchsten ANI- (98,08 %) und DDH-Werte (71,04) wurden gegen den A. colistiniresistens-Stamm NR1165 (Supplementary B) gefunden. Ein phylogenetischer Baum wurde auf der Grundlage von 20 A. colistiniresistens-, drei A. baumannii-, einem A. gyllenbergii- und einem A. proteolyticus-Genomen erstellt, und es ist klar, dass C-214 ein Genomvar innerhalb der A. colistiniresistens-Gruppe ist, die selbst ein Genom ist bestehend aus zwei Untergruppen (Abb. 2).

Der phylogenomische Baum von Acinetobacter colistiniresistens, kommentiert mit ANI-Werten und einer prozentualen Identitätsmatrix gegen antimikrobielle Resistenzgene von CARD. Beachten Sie, dass der Typstamm NIPH2036 durch die Genomassemblierung GCF_000413935.1, das 13BJ/14TU-Isolat durch GCF_003227755.1 und drei TUM-Isolate durch GCF_009013115.1, GCF_9013295.1 und GCF_9013055.1 repräsentiert wird.

Die unterschiedlichen Muster der Antibiotikaresistenz-Phänotypen, die im Stamm C-214 beobachtet wurden, veranlassten uns, die bekannten Gene, die mit der Resistenz im sequenzierten Genom verbunden sind, zu untersuchen und sie mit anderen verfügbaren A. colistiniresistens-Genomen zu vergleichen. Darüber hinaus verglichen wir auch das Vorhandensein von AMR-Genen in drei A. baumannii-, einem A. gyllenbergii- und einem A. proteolyticus-Genom. Detaillierte Ergebnisse sind in Abb. 2 zusammengefasst. Bei der AMR-Genanalyse mithilfe der CARD-Datenbank wurden fünf Antibiotika-Resistenzgene im Genom des Stamms C-214 nachgewiesen, wobei ein Tetracyclin-Resistenzgen (tet39) in einem Plasmid (p214-1) gefunden wurde. Darüber hinaus waren im Isolat auch ein Beta-Lactam-Resistenzgen blaOXA302, zwei Aminoglycosid-Resistenzgene (ANT(3'')-IIc, AAC(6')-Ij) und das Multidrug-Efflux-Pump-Gen adeB vorhanden. Der Nachweis dieser Gene stützte auch unsere AST-Phänotypdaten (Tabelle 1), bei denen der Stamm C-214 eine Resistenz gegen Beta-Lactame (CTX-30), Tetracyclin (TE30) und Aminoglycosid (AK30) zeigte. Obwohl das Isolat eine hohe Resistenz gegen Colistin und Polymyxin B aufweist, konnte das für die Resistenz verantwortliche Gen nicht identifiziert werden. Studien haben ergeben, dass das Plasmid-vermittelte Gen mcr für die Colistin-Resistenz bei Acinetobacter baumannii46 verantwortlich ist. Wir konnten in keinem A. colistiniresistens-Isolat ein mcr-Gen finden.

Nach einem Vergleich der mutmaßlichen Resistenzgene in C-214 mit 19 anderen A. colistiniresistens-Stämmen wurde festgestellt, dass die meisten Isolate eine ähnliche Sammlung von Resistenzgenen trugen (n ≤ 5). Das Tetracyclin-Resistenz-A-Gen (tet39) wurde jedoch nur in dem in dieser Arbeit beschriebenen Stamm C-214 nachgewiesen. Sowohl im Chromosom als auch im Plasmid (p214-1) wurde eine Insertionssequenz ISaba26 nachgewiesen. Darüber hinaus wurden beim Vergleich der von Acinetobacter abgeleiteten Cephalosporinasen (ADCs) zwischen A. colistiniresistens-Isolaten und A. baumannii erhebliche Unterschiede beobachtet. Sowohl A. baumannii als auch die A. colistiniresistens-Isolate trugen das intrinsische Beta-Lactamase-Gen der Klasse C. Während jedoch die in dieser Studie analysierten A. baumannii-Isolate ein Gen vom ADC-1-Typ trugen, trugen die A. colistiniresistens ein Gen vom ADC-8-Typ (Abb. 3). Die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen dieser beiden Typen beträgt etwa 50 %. Effluxpumpen-bezogene Gene wurden häufig in beiden A. baumannii-Stämmen gefunden, in den A. colistiniresistens-Isolaten wurden jedoch nur zwei Gene gefunden.

Phylogenetischer Baum basierend auf kuratierten Beta-Lactamasen der Ambler-Klasse C aus BLDB und den Sequenzen UniRef90_N9PW73 und UniRef50_A0A0M1I997. AmpC-Sequenz aus C-214-Clustern zusammen mit UniRef90_N9PW73-Sequenzen. In Grün sind die von Acinetobacter abgeleiteten Cephalosporinasen (ADCs) mit Ausnahme von ADC-8 dargestellt. Die braune Gruppe ist eine Klade, die aus UniRef50_A0A0M1I997-Sequenzen besteht. UniRef50-Sequenzen sind Sequenzen, die einen Ähnlichkeitscluster von 50 % bilden (50 % ist hier angeblich ein milder Grenzwert). Wir können auch sehen, dass der UniRef50_A0A0M1I997-Cluster zwei Unterklassen bildet. Das C-214 ampC-Gen (UniRef90_N9PW73 „sub-“subclade, rot) fällt nicht unter die ADC-8-Subclade. Hier beziehen sich die aus drei Buchstaben bestehenden Namen auf verschiedene Beta-Lactamasen, die alle zur Klasse C gehören.

Im C-214-Stamm wurden verschiedene Virulenzfaktor-bezogene Gene analysiert, zusammen mit 19 anderen A. colistiniresistens-, drei A. baumannii-, einem A. gyllenbergii- und einem A. proteolyticus-Genom, die von NCBI abgeleitet waren, wobei zwei A. baumannii-Genome davon stammten Projekt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 zusammengefasst. Das Gen ompA des Außenmembranproteins, das die Bildung von bakteriellem Biofilm, die Infektion eukaryotischer Zellen, die Antibiotikaresistenz und die Immunmodulation fördert, wurde in allen A. colistiniresistens-Isolaten, einschließlich C-21447, gefunden. Gene, die mit der Produktion von Lipopolysacchariden (LPS) in Zusammenhang stehen, wie z. B. lpxA, B, C, D und lpxL, waren in allen Genomen von A. colistiniresistens vorhanden. Die Gene lpxA, lpxC und lpxD sind hauptsächlich an den Anfangsstadien der Lipid-A-Produktion und dem hydrophoben Anker von LPS48 beteiligt. Es wurde festgestellt, dass Mutationen in lpxA, lpxC und lpxD eine Rolle bei der Entwicklung einer Colistin-Resistenz spielen können48. Wir verglichen diese aus WGS erworbenen lpx-Gene aller A. colistiniresistens und drei A. baumannii Colistin-sensitiven Stämme (Stamm vom Typ A. baumannii ATCC19606, A. baumannii H-10112, A. baumannii C-98) (Ergänzung A, Abb. S1). Wir fanden ähnliche Polymorphismen in den lpxA/C/D- und lpxL-Genen in allen A. colistiniresistens-Stämmen, was darauf hindeutet, dass Veränderungen im LPS-Metabolismus der Grund für die bei diesen Stämmen beobachtete Colistin-Resistenz sein könnten. Wir fanden auch andere Gene, die mit dem Virulenzfaktor in Zusammenhang stehen, darunter: Typ-VI-Sekretionssystem, Stressanpassung, Antiphagozytose, Zweikomponenten-Regulationssystem (bfmR, bfmS), Serumresistenz, Eisenaufnahme und Adhärenzgene. Während die meisten Isolate ähnliche virulenzbezogene Gene aufwiesen (Abb. 4), wurden bestimmte Unterschiede zwischen A. colistiniresistens- und A. baumannii-Isolaten festgestellt. Obwohl sowohl Krankenhaus- als auch Gemeinde-A. baumannii-Isolate über einen vollständigen Satz von Typ-VI-Sekretionssystem-Genen verfügten, wurden in sechs A. colistiniresistens-Isolaten, einschließlich C-214, nur ein bis drei Gene gefunden, die dieses System kodieren. Gene des Typ-VI-Sekretionssystems (T6SS) gelten allgemein als entscheidender Virulenzfaktor in A. baumannii und von T6SS-Genen produzierte Toxine könnten andere Bakterien sowie eukaryontische Zellen abtöten49.

Vorhandensein von Genen, die an der Virulenz beteiligt sind, im Stamm C-214 und 19 weiteren Genomen von A. colistiniresistens, drei A. baumannii, einem A. gyllenbergii und einem A. proteolyticus. Das Vorhandensein von Genen in einem Isolat wird durch ein farbiges Rechteck angegeben, das entsprechend der Sequenzähnlichkeit mit kuratierten VFDB-Sequenzen gefärbt ist. Das Fehlen von Genen wird als Leerzeichen ohne Farbe angezeigt.

Umfangreiche Untersuchungen zur Pangenomanalyse können dabei helfen, die funktionelle Anpassungsfähigkeit einer Bakterienart zu verstehen50. Um einen Einblick in die genomübergreifenden Informationen von A. colistiniresistens zu erhalten, haben wir verschiedene Diagramme erstellt, um die Anzahl der Gesamtgene, der akzessorischen Kerngene und der einzigartigen Gene als Funktion der sequenzierten Genome zu visualisieren.

Acinetobacter colistiniresistens wird in zwei Genomovare eingeteilt. Um die genomische Vielfalt zu untersuchen, führten wir eine Pan-Genom-Analyse mit dem Anvi'o-Pan-Genom-Workflow40 durch (Abb. 5). Das Pan-Genom bestand aus insgesamt 6825 Genen, wobei 2601 Kerngene von allen Stämmen gemeinsam genutzt wurden und 2179 Kerngene nur einmal vorkamen. Darüber hinaus untersuchten wir die Anreicherung zwischen den beiden Genomovaren51. Die Anreicherung wurde als ein Anreicherungsscore von mehr als 15 und ein angepasster q-Wert unter 0,01 definiert. Die Analyse der funktionellen Anreicherung wurde basierend auf der COG20-Annotation (Ergänzung B) durchgeführt. Unser Stamm, C-214, wurde in Klade 2 gefunden, die eine Anreicherung von 17 Genen aufwies, während Klade 1 eine Anreicherung von acht Genen aufwies. Die Genome wurden nach dem Stammbaum geordnet (Abb. 5).

Anvi'o-Pangenom-Anzeige von 20 A. colistiniresistens-Genomen. Die Schichten wurden entsprechend den beiden vorgeschlagenen A. colistiniresistens-Genomovaren gefärbt. Die Genome wurden basierend auf dem phylogenomischen Baum aus Abb. 2 sortiert. Gencluster wurden basierend auf der Anwesenheit und Abwesenheit von Genen sortiert. Angezeigt wurden Gencluster, die unter die Einzelkopie-Gene und das Kerngenom fallen. Es wurden auch Balkendiagramme gezeigt, die Singleton-Gencluster für jedes Genom darstellen.

Die Pathogenität von A. colistiniresistens C-214 wurde im G. mellonella-Modell getestet und mit einem virulenten A. baumannii-Stamm C-98 (unveröffentlicht) und einem nicht virulenten E. coli OP-50 verglichen. Abbildung 6 verdeutlicht die Variabilität der Pathogenität in zwei verschiedenen bakteriellen Inokulums.

Kaplan-Meier-Überlebensverteilungen für dosisabhängige Herausforderungen von A. colistiniresistens C-214. A. baumannii C-98 und E. coli OP50 wurden in allen Dosierungsstufen als hochvirulente bzw. nichtvirulente Stammkontrollen verwendet. Drei biologische Wiederholungen jedes Experiments wurden zusammengefasst und die Ergebnisse werden als prozentuale Überlebenswahrscheinlichkeit angezeigt. Die Infektionsergebnisse für alle drei getesteten Isolate waren signifikant unterschiedlich (p = 0,001; Mantel-Cox-Log-Rank-Test, was zeigt, dass das Überleben der Larven von der Menge der injizierten Bakterien abhängt.

Wir verabreichten parenterale Injektionen von zwei verschiedenen Konzentrationen (107 und 106 KBE) des A. colistiniresistens-Stammes C-214, um die Auswirkung auf die Pathogenität der Larven zu untersuchen. Die infizierten Larven zeigten deutliche Symptome, darunter Knötchenbildung, Schwärzung der Kutikula und schließlich Tod. Bemerkenswert ist, dass der Grad der Melanisierung mit höheren Inokulumdosen deutlich zunahm, was darauf hindeutet, dass die anfängliche Größe des infektiösen Inokulums eine entscheidende Rolle für das Fortschreiten der Infektion spielt. Um die Überlebensergebnisse zu analysieren, verwendeten wir Kaplan-Meier-Überlebensverteilungen für jedes Bakterieninokulum und führten einen Log-Rank-Test (Mantel-Cox) durch, der signifikante Unterschiede ergab (p < 0,001). Die Überlebenswahrscheinlichkeit der Larven hing von der Anzahl der injizierten KBE ab. Bei Larven, denen eine Inokulumgröße von 107 KBE/Larve injiziert wurde, betrug die Überlebensrate nach 24 Stunden 40 % für A. colistiniresistens C-214, 0 % für A. baumannii C-98 und 100 % für das nicht virulente E. Coli-Stamm OP50. Allerdings sank die Überlebensrate der mit C-214 behandelten Larven nach 120 Stunden auf 0 %. Im Vergleich dazu zeigten Larven, denen 106 KBE/Larve injiziert worden war, nach 24 Stunden eine Überlebensrate von 90 % für C-214, 20 % für C-98 und 100 % für OP-50. Innerhalb des Beobachtungszeitraums von 168 Stunden nach der Inokulation überlebten 60 % der mit C-214 behandelten Larven. Eine weitere Verdünnung (105 KBE/Larve) führte zu einem Überleben von 100 %, zeigte jedoch nach 168-stündiger Beobachtung eine Melanisierung bei 30 % der Population.

MDR Acinetobacter baumannii ist ein bedeutender nosokomialer Krankheitserreger, der im Mittelpunkt der meisten Forschungen zu Acinetobacter spp. stand. Abgesehen von A. baumannii ist über andere Acinetobacter-Arten wenig bekannt. Allerdings werden nicht-baumannii Acinetobacter-Arten zunehmend als Erreger nosokomialer Infektionen identifiziert. Ein solcher Organismus, A. colistiniresistens, wurde aus verschiedenen Quellen isoliert, darunter Sputum, Blut, Wundabstrich, Katheter und Bindehaut bei Krankenhauspatienten5,6,52 (Ergänzung B). Die genomischen Merkmale dieses Organismus wurden jedoch selten diskutiert11,52. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Charakterisierung des Stammes A. colistiniresistens, der aus einer gesunden menschlichen Stuhlprobe isoliert wurde. Dieser Bericht stellt eine bedeutende Entdeckung dar, da es sich um den ersten bekannten Fall handelt, bei dem diese Art aus einem gesunden Individuum isoliert wurde. Die Studie liefert neue Informationen zu den Genom- und Virulenzmerkmalen von A. colistiniresistens, die bei der Behandlung dieses speziellen Krankheitserregers nützlich sein könnten.

Behandlung von Infektionen durch Acinetobacter spp. ist aufgrund ihrer Multiresistenzmuster (MDR) und Panresistenzmuster (PDR) immer schwieriger geworden. Colistin gilt allgemein als das letzte Mittel gegen MDR-Acinetobacter-Infektionen. Daher wirft das Vorhandensein von A. colistiniresistens in einer gesunden Gemeinschaft, die von Natur aus gegen Colistin resistent ist11,12, erhebliche Bedenken hinsichtlich der öffentlichen Gesundheit auf. Das C-214-Isolat zeigte eine hohe Resistenz sowohl gegen Colistin als auch gegen Polymyxin B mit minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von 32 bzw. 16. Dieses Resistenzprofil ist vergleichbar mit dem des NR1165-Isolats, über das in einer in Japan durchgeführten Studie5 berichtet wurde, was die Bedenken hinsichtlich der Ausbreitung solcher resistenter Stämme weiter verschärft.

Baraka et al.53 identifizierten Resistenzgene gegen Sulfonamide, Makrolide, ABC-F und Beta-Lactamasen-Antibiotika in zuvor isolierten A. colistiniresistens. In ähnlicher Weise ergab die WGS des A. colistiniresistens-Stammes C-214 mehrere Resistenzgene, darunter das Beta-Lactam-Resistenzgen blaOXA302, das Tetracyclin-Resistenzgen tet39, die Aminoglycosid-Resistenz ANT(3'')-IIc und AAC(6')-Ij, die ebenfalls unsere bestätigten AST-Daten. Das Vorhandensein von Plasmiden, die Gene wie tet39 tragen, macht diesen Stamm für die Gemeinschaft gefährlicher, da er dadurch möglicherweise Resistenzgene durch horizontalen Gentransfer auf andere Arten übertragen kann54.

Eine vergleichende WGS-Studie mit neunzehn anderen vom NCBI entnommenen A. colistiniresistens ergab, dass die meisten A. colistiniresistens-Isolate ähnliche Arten von AMR-Genen enthielten, mit Ausnahme von zwei Stämmen (NR1165, DL), die mehr AMR-Gene trugen, darunter Carbapenemase-Gene, die für OXA-58 kodieren. IMP-34- und ESBL-Gen, das für TEM-181 kodiert.

Obwohl die A. colistiniresistens-Isolate einige Virulenzeigenschaften von A. baumannii teilten, gab es einige bemerkenswerte Unterschiede. Beispielsweise war die Genzahl des Typ-VI-Sekretionssystems in den A. colistiniresistens-Isolaten niedriger. Obwohl A. baumannii und A. colistiniresistens unterschiedliche Unterklassen von Typ-VI-sekretionsbezogenen Genen tragen, könnte die Anzahl der bei A. colistiniresistens verlorenen Gene von entscheidender Bedeutung sein. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Stummschaltung des chromosomal kodierten Typ-VI-Sekretionssystems entscheidend für den horizontalen Gentransfer durch Konjugation ist, der für die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen von entscheidender Bedeutung ist55. Daher bedarf das Typ-VI-Sekretionssystem in A. colistiniresistens weiterer Untersuchungen hinsichtlich seiner Virulenz- und Resistenzeigenschaften. Es ist zu beachten, dass die Person, die den in dieser Studie isolierten A. colistiniresistens in sich trug, zwar nicht Träger von A. baumannii war, ein solches Vorkommen jedoch in der Zukunft möglich ist. In einer solchen Situation könnte die Übertragung zusätzlicher Resistenzen auf A. baumannii oder umgekehrt dazu führen, dass der Organismus gegen alle derzeit verwendeten Medikamente resistent wird. Folglich würden Infektionen durch solche Organismen schwierig zu behandeln sein.

Kürzlich wurden nicht-tierische In-vivo-Modelle wie G. mellonella verwendet, um die Virulenz von Krankheitserregern wie A. baumannii, P. aeruginosa, Burkholderia cepacia, Bacillus cereus und krankheitserregenden Pilzen zu bestimmen18,56. G. mellonella verträgt Inkubationstemperaturen von bis zu 37 °C und ist daher für die Erforschung menschlicher Krankheiten bevorzugt56. Außerdem vermehrt es sich schnell und erfordert keine tierethische Genehmigung. In unserer Studie zeigte G. mellonella eine dosisabhängige Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion mit A. colistiniresistens (C-214) und könnte zur Erforschung seiner Pathogenität genutzt werden.

Zusammenfassend beschreibt diese Studie die erste vollständige Genomsequenz des Stammes A. colistiniresistens, die aus der Stuhlprobe einer gesunden erwachsenen Frau aus Malaysia isoliert wurde. Zu den hervorstechenden genomischen Merkmalen dieses Stammes gehörte das Vorhandensein von Genen, die für AMR und Virulenz relevant sind. MDR A. colistiniresistens ist ein opportunistischer Krankheitserreger und von Natur aus resistent gegen Colistin, was Anlass zu großer Sorge gibt, da es sich um ein Antibiotikum der letzten Instanz handelt. Darüber hinaus zeigte der In-vivo-Test zur Abtötung von G. mellonella das pathogene Potenzial des Stamms C-214 an. Der Transport von A. colistiniresistens in der asymptomatischen Gemeinschaft stellt ein Risiko für die öffentliche Gesundheit dar, und der epidemiologischen Überwachung und Übertragung dieses Bakteriums sollte mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden.

Die zusammengesetzte Genomsequenz wurde in der GenBank- und NCBI-Datenbank unter der Projektnummer PRJNA863728 hinterlegt. (Die GenBank-Zugangsnummern für andere zum Vergleich verwendete A. colistiniresistens-Stämme sind in Ergänzung B aufgeführt.)

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Die Autoren möchten der multidisziplinären Plattform für tropische Medizin und Biologie, der School of Science, der Monash University Malaysia und dem South East Asia Community Observatory für ihre Unterstützung danken. Wir möchten auch den Beitrag von Dr. Aswini Leela zur Assemblierung des gesamten Genoms von C-214 würdigen. Teile dieser Arbeit wurden durch die Nutzung der MASSIVE HPC-Anlage (http://www.massive.org.au) unterstützt.

Diese Studie wurde durch ein Fundamental Research Grant Scheme (FRGS) des Bildungsministeriums (MOE) Malaysia (Grant Number FRGS/1/2019/SKK01/MUSM/01/1), Monash Malaysia Strategic Large Grant Scheme 2017 (LG-) unterstützt. 2017–01-SCI) und das Tropical Medicine and Biology 2017 Grant für das Projekt „Malaysisches Mikrobiom in Gesundheit und Krankheit“.

School of Science, Monash University Malaysia, Bandar Sunway, 47500, Subang Jaya, Selangor Darul Ehsan, Malaysia

Nazmul Hasan Muzahid, Muhammad Zarul Hanifah Md Zoqratt, Kah Ern Ten, Md Hamed Hussain, Qasim Ayub, Hock Siew Tan und Sadequr Rahman

South East Asia Community Observatory (SEACO), Global Public Health, Jeffrey Cheah School of Medicine and Health Sciences, Monash University Malaysia, Bandar Sunway, 47500, Subang Jaya, Selangor, Malaysia

Zinn Zinn Su

Genomics Facility der Monash University Malaysia, Bandar Sunway, 47500, Subang Jaya, Selangor Darul Ehsan, Malaysia

Qasim Ayub & Sadequr Rahman

Multidisziplinäre Plattform für Tropenmedizin und Biologie, Monash University Malaysia, Bandar Sunway, 47500, Subang Jaya, Selangor, Malaysia

Hock Siew Tan & Sadequr Rahman

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NHM-Konzeptualisierung, Methodik, formale Datenanalyse und Erstellung des Hauptmanuskripts. MZHMZ, KET und MHH führten die Datenerhebung durch. TTS, QA, HST und SR haben das Experiment entworfen. SR betreute das Projekt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Nazmul Hasan Muzahid oder Sadequr Rahman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Muzahid, NH, Md Zoqratt, MZH, Ten, KE et al. Genomische und phänotypische Charakterisierung von Acinetobacter colistiniresistens, isoliert aus dem Kot eines gesunden Mitglieds der Gemeinschaft. Sci Rep 13, 12596 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39642-0

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39642-0

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