Molekulare Architektur und Konservierung eines unreifen menschlichen endogenen Retrovirus

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5149 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das humane endogene Retrovirus K (HERV-K) ist das zuletzt erworbene endogene Retrovirus im menschlichen Genom und wird bei vielen Krebsarten und amyotropher Lateralsklerose aktiviert und exprimiert. Wir präsentieren die unreife HERV-K-Kapsidstruktur mit einer Auflösung von 3,2 Å, die aus nativen virusähnlichen Partikeln mittels Kryo-Elektronentomographie und Subtomogramm-Mittelung ermittelt wurde. Die Struktur zeigt eine durch ein 6-Helix-Bündel oligomerisierte Hexamereinheit, die durch ein kleines Molekül analog zu IP6 im unreifen HIV-1-Kapsid stabilisiert wird. Das unreife HERV-K-Gitter wird über hochkonservierte Dimer- und Trimer-Grenzflächen aufgebaut, wie durch Simulationen der Molekulardynamik aller Atome detailliert beschrieben und durch Mutationsstudien gestützt. Während der HERV-K-Reifung kommt es zu einer großen Konformationsänderung, die durch den Linker zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Domäne von CA vermittelt wird. Der Vergleich zwischen HERV-K und anderen retroviralen unreifen Kapsidstrukturen zeigt einen hochkonservierten Mechanismus für den Aufbau und die Reifung von Retroviren über Gattungen und Evolutionszeiten hinweg.

Bei der ersten Sequenzierung des menschlichen Genoms wurde festgestellt, dass etwa 8 % in die breite Klasse der humanen endogenen Retroviren (HERVs)1 eingeteilt werden können. Diese Viren haben sich über Millionen von Jahren in das Genom integriert und die meisten haben Mutationen angesammelt, die sie nicht infektiös machen. HERV-K (HML-1 bis HML-10) ist die zuletzt aufgenommene und aktivste Virusgruppe, insbesondere ihre Untergruppe HML-2. HERV-K ist mit Hunderten von Kopien im Genom vorhanden und einige HERV-K-Kopien bestehen aus einem vollständigen offenen Leseraster mit allen vorhandenen strukturellen und regulatorischen Proteinen, aber aufgrund von Mutationen in einigen Proteinen kann keines den viralen Lebenszyklus abschließen. Während HERV-K in gesunden adulten Zellen nicht exprimiert wird, sind einige Loci bei verschiedenen Krebsarten2,3,4,5,6, bei Amyotropher Lateralsklerose (ALS)7, während einer HIV-1-Infektion8 und seit neuestem auch in Organen und Geweben hochreguliert von alten Primaten und Mäusen9,10. Wenn HERV-K-Kopien in diesen Zellen exprimiert werden, können sie virusähnliche Partikel (VLPs) produzieren, die nicht infektiös sind. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine Konsenssequenz, die auf zehn Proviren von HERV-K in voller Länge basiert und als KERV-Kcon bezeichnet wird, infektiöse Virionen produziert11,12, deren Lebenszyklus durch eine Vielzahl von Restriktionsfaktoren wie Tetherin und Mitglieder der APOBEC-Familie gehemmt wird exogene Retroviren einschränken. Daher dient HERV-K als Paradigma für das Verständnis der Architektur und Eigenschaften endogener Retroviren, wenn sie vor Tausenden von Jahren in das menschliche Genom integriert wurden. Sie stellen einen in unserem Genom gespeicherten Fossilienbestand dar und stellen ein Erhaltungsmuster dar, das sich über Millionen von Jahren im Zusammenspiel zwischen Retroviren und ihren Wirten entwickelt hat. Darüber hinaus ist HERV-K auch von medizinischer Bedeutung, da HERV-K-VLPs in jungen Zellen Seneszenz induzieren10 und eine Reihe von Genen während der Tumorentstehung unter eindeutiger Transkriptionskontrolle durch HERV-K-Loci stehen13.

Phylogenetisch gehört HERV-K zur Betaretrovirus-ähnlichen Supergruppe, da seine Sequenz dem Maus-Brusttumorvirus (MMTV) am ähnlichsten ist14,15. Das Hauptstrukturprotein Gag reicht aus, damit HERV-K unreife VLPs produziert. Bei der Reifung wird Gag durch seine Protease in Matrix (MA, bindet an die Membran), p15, Kapsid (CA, bildet den inneren Kern), Nukleokapsid (NC, bindet die RNA) und drei Spacerpeptide (SP1, QP1 und QP2) gespalten. 16,17. Die Struktur des reifen HERV-K-Kapsids wurde kürzlich durch Einzelpartikel-KryoEM aufgeklärt, wobei In-vitro-Assemblierungen aus rekombinantem HERV-Kcon-Kapsidprotein (CA)18 verwendet wurden. Die unreife HERV-K-Gag-Struktur und ihr Zusammenbau als unreifes Gitter sind jedoch weiterhin unklar.

Hier präsentieren wir eine KryoET-Studie der nativen unreifen HERV-Kcon-Gag-VLPs, die aus menschlichen Zellen freigesetzt werden. Interessanterweise sind HERV-Kcon-Gag-VLPs viel größer als andere bekannte Retroviren, mit einem wesentlich größeren Spalt zwischen der Membran und der Kapsidschicht. Wir verwendeten KryoET und Subtomogramm-Mittelung (STA), um die Struktur der HERV-K-CA-Domäne von unreifem Gag mit einer Auflösung von 3,2 Å zu bestimmen. Seine Gesamtstruktur ähnelt der anderer Retroviren und zeigt eine starke Konservierung zwischen menschlichen endogenen und exogenen Retroviren. Während die einzelnen N-terminalen (NTD) und C-terminalen (CTD) Domänen des Kapsids zwischen der reifen und der unreifen Form strukturell konserviert sind, ist das Gelenk zwischen diesen beiden Domänen jedoch unterschiedlich, was zu stark unterschiedlichen NTD- und CTD-Ausrichtungen führt und folglich unterschiedliche Gitter für das reife und unreife HERV-K. Das Vorhandensein einer konservierten Dichte an der Spitze des 6-Helix-Bündels (6HB) des unreifen CA-Hexamers, koordiniert durch zwei Ringe aus konservierten Lysinresten, lässt auf einen bemerkenswert ähnlichen Mechanismus von Inositolhexaphosphaten (IP6) bei der HERV-K-Assemblierung schließen Infektion im Vergleich zu IP6 bei HIV-1 und anderen Retroviren wie EIAV und RSV19,20,21.

Um die Morphologie von HERV-K mit exogenen Viren zu vergleichen, exprimierten wir HERV-Kcon-VLPs (im Folgenden der Einfachheit halber HERV-K) in HEK293T-Zellen und reinigten sie mit einer abschließenden Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (ergänzende Abbildung 1a). Es gab zwei VLP-haltige Banden im Gradienten, die dann zur KryoET-Analyse separat in flüssigem Ethan tauchgefroren wurden. Das obere Band wies viele fusionierte VLPs auf (ergänzende Abbildung 1b, Tafel III), während das untere Band hauptsächlich aus gut geformten einzelnen VLPs bestand, die für die Strukturanalyse geeignet waren. Diese VLPs haben eine kugelförmige Form, enthalten eine äußere Lipiddoppelschicht und einen inneren Ring für das CA-Gitter (Abb. 1a – c). Der Durchmesser der HERV-K-VLPs reicht von 120 nm bis 210 nm mit einem mittleren Durchmesser von ~173 nm (Abb. 1e) und ist damit deutlich größer als bei anderen Retroviren, einschließlich HIV-1 und HIV-2, RSV, MLV, HTLV- 1 und HFV22. Im Vergleich zu den unreifen HIV-1-VLPs scheint eine größere Lücke zwischen der Lipiddoppelschicht und dem Kapsidgitter zu bestehen (Abb. 1c, d). Wir haben außerdem den Abstand zwischen Membran und CA gemessen, was zu einem Spaltabstand im Bereich von 16 nm bis 24 nm mit einem Mittelwert von 21 nm führte, viel größer als der Spalt bei HIV-1 (~10 nm)22, aber nahe daran die Lücke im RSV (~18 nm)22 (Abb. 1f).

a Schematische Darstellung von Gag-Domänen. b–d Repräsentative KryoEM-Bilder gereinigter unreifer HERV-K-VLPs bei niedriger (b), mittlerer (c) und hoher (d) Vergrößerung. e Der Mittelwert (rote Linie) und die Verteilung (graue Balken) des Durchmessers (roter Pfeil in d) von HERV-K-VLPs im Vergleich zu den mittleren Durchmessern anderer Retroviren (blaue Linien). f Der Mittelwert (violette Linie) und die Verteilung (graue Balken) des Abstands zwischen Lipiddoppelschicht und Kapsidgitter (lila in d) von HERV-K-VLPs im Vergleich zum mittleren Abstand anderer Retroviren (blaue Linien). Die mikroskopischen Aufnahmen in (b) und (c, d) sind repräsentativ für 20 bzw. 124 Messungen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der größere Abstand zwischen dem CA-Gitter und der Membran ist höchstwahrscheinlich auf das Vorhandensein der Segmente SP1 und p15 zwischen MA und CA zurückzuführen. P15 kodiert für ein spätes (L) Domänenmotiv, das für die Rekrutierung von Wirtsproteinen benötigt wird, die für die Freisetzung von Virionen aus der Plasmamembran verantwortlich sind16,17. HIV-1, HIV-2 und HTLV-1 haben keine zusätzlichen Domänen zwischen MA und CA. MMTV hat 4 Proteine (pp21, p3, p8, n) ohne eine späte Domäne, aber p8 und n sind für den Zusammenbau erforderlich23. M-PMV, RSV und MLV kodieren jeweils zusätzliche Segmente zwischen MA und CA (pp24(L)/p12; p2a/p2b(L)/p10(L); p12(L) bzw.)24,25,26,27,28 und weisen daher im Vergleich zu HIV-122,29 eine größere Lücke auf. Der beobachtete große Abstand zwischen der Membran und dem CA-Gitter in HERV-K korreliert gut mit dem Vorhandensein dieser zusätzlichen Segmente zwischen MA und CA.

Die unreifen HERV-K-VLPs sind heterogen mit unterschiedlichen Größen und Morphologien (Abb. 1). Daher verwendeten wir KryoET in Kombination mit STA, um die Struktur des unreifen CA-Gitters zu bestimmen. Die Schwerpunkte von ca. 800 VLPs wurden rechnerisch aus den Tomogrammen automatisch ermittelt und als Ausgangspunkte verwendet, um mithilfe unbeaufsichtigter Segmentierungsroutinen die Position der Außenfläche des CA-Gitters zu ermitteln. Entlang des CA-Gitters aller VLPs wurden 270 K gleichmäßig verteilte Positionen identifiziert und Teilvolumina mit einer Seitenlänge von 40 nm zur weiteren Verarbeitung extrahiert (ergänzende Abbildung 2a). Die Mittelung des Subtomogramms und die anschließende Analyse der Rohprojektionen der Neigungsreihen unter Verwendung von STA-Verfeinerungsverfahren, die die Einschränkungen der Neigungsgeometrie auferlegen, führten zu einer Karte mit einer Auflösung von 3,2 Å (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2b). Die Zuordnung einzelner Subtomogramme zu den ursprünglichen Tomogrammen zeigt, dass die verfeinerten Subtomogrammpositionen in einem hexagonalen Gitter mit eingebauten Lücken angeordnet sind, um der Gitterkrümmung Rechnung zu tragen (ergänzende Abbildung 3). Diese Art von hexagonalem, unreifem CA-Gitter kommt in vielen anderen Retroviren vor und scheint ein konserviertes Merkmal aller retroviralen Gattungen zu sein. Es hat sich daher wahrscheinlich früher entwickelt als die Integration von HERV-K in das menschliche Genom. Durch die Subtomogramm-Mittelung konnte die CA-Domäne von Gag (Gag-Aminosäuresequenz 283–532) aufgelöst werden, und für MA oder NC wurde keine gut aufgelöste Dichte beobachtet. Seitenketten in der STA-Karte von unreifem HERV-K-CA wurden klar aufgelöst (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2b, d), wodurch die Erstellung eines Atommodells ermöglicht wurde (Abb. 2b). Das CA-Monomer besteht aus einer N-terminalen Domäne mit 7 Helices und einer C-terminalen Domäne bestehend aus den Helices 8-11 und einer terminalen Helix 12 (Abb. 2c, d). Der Linker zwischen NTD und CTD ist ebenfalls gut aufgelöst. Die ersten 21 Aminosäuren am N-Terminus sind flexibel und wurden nicht in das Atommodell einbezogen.

eine CryoET-STA-Karte des unreifen HERV-K-CA-Hexamers, gefärbt durch lokale Auflösung (rot bis blau). b Eine Platte der HERV-K-CA-Hexamerkarte, überlappt mit dem Atommodell (Regenbogenfarben blau bis rot, N-Terminus bis C-Terminus). c Das Atommodell des unreifen HERV-K-CA-Monomers (NTD in Blau, CTD in Orange). , h12 in Rot) mit beschrifteten α-Helices. d Das Atommodell des unreifen HERV-K-Hexamers, von der Seite und von oben gesehen, mit einem in Blau und Orange gefärbten Monomer. e Ein zentraler Schnitt der HERV-K-Hexamer-Dichtekarte, Zeigt die IP6-Dichte mit einem angepassten IP6 (roter Pfeil) und zwei Lys-Ringen (K166 und K240) zusätzlich zum hydrophoben Kern des 6HB (M244 und I248). f, g Dichteplatten oben (f, oben gestrichelter Kasten). in e) und unten (g, unterer gestrichelter Kasten in e) des 6HB, wobei die hervorstehenden Seitenketten als Stäbchen dargestellt sind. h Das Dimer (schwarzer Kreis) und das Trimer (roter Kreis) sind Grenzflächen zwischen benachbarten unreifen HERV-K-Hexameren. i Eine detaillierte Ansicht der Trimer-Grenzfläche, an der Helix 4 beteiligt ist, wobei die beteiligten Seitenketten als Stäbchen dargestellt sind. j Eine detaillierte Ansicht der Dimer-Grenzfläche, an der Helix 9 beteiligt ist, wobei die beteiligten Seitenketten als Stäbchen dargestellt sind.

Wie bei anderen retroviralen unreifen CA-Strukturen sind im Hexamer29 keine NTD-CTD-Interaktionsschnittstellen vorhanden. Die CA-Monomere fügen sich über die terminalen Helices h12 zu einem Hexamer zusammen und bilden das 6HB (Abb. 2d). An der Spitze des 6HB gibt es eine starke Dichte, die höchstwahrscheinlich dem 647,94 Da großen Myoinositolhexakisphosphat (IP6)-Molekül entspricht, koordiniert durch zwei Ringe aus Lysinresten, K166 und K240 (Abb. 2e, f), die bemerkenswert ähnlich sind zum unreifen CA-Hexamer in HIV-1, wo das IP6-Molekül die Ladungen von zwei Lysinringen, K158 und K227, neutralisiert und so das 6HB30 stabilisiert. Weiter stromabwärts im 6HB erleichtern hydrophobe Reste an der Innenseite des 6HB die Bündelbildung (Abb. 2e, g). Der Aufbau des unreifen CA-Gitters wird hauptsächlich durch die hydrophoben Wechselwirkungen an den Grenzflächen des Trimers (N-terminale h4-Helix) und des Dimers (C-terminale h9-Helix) zwischen benachbarten Hexameren vermittelt (Abb. 2h – j). Im Gegensatz dazu weist das Mason-Pfizer-Affenvirus (M-PMV), die einzige unreife Struktur, die in der Familie der Betaretroviren gelöst wurde, kein 6-Helix-Bündel am C-Terminus oder an der N-terminalen Trimerschnittstelle auf31. Das Vorhandensein der CA-NC-Verbindung von M-PMV ist jedoch immer noch von entscheidender Bedeutung für den Zusammenbau, die Reifung und die Infektiosität31. Da sich HERV-K im Gegensatz zu anderen Betaretroviren, die sich im Zytoplasma ansammeln, an der Plasmamembran2 ansammelt, könnte das 6HB ein Merkmal sein, das bei einigen Betaretroviren irgendwann während der Virusentwicklung verloren gegangen ist.

Vor der Durchführung von Molekulardynamiksimulationen haben wir ein Strukturmodell des HERV-K-CA-Hexamers durch vergleichende Modellierung mit RosettaCM32 erstellt und verfeinert (ergänzende Abbildung 4). Das verfeinerte Modell wurde verwendet, um Molekulardynamiksimulationen zusammenzustellen und durchzuführen, um die strukturelle Integrität und Gesamtstabilität von Wechselwirkungen zu untersuchen, die an den Trimer- und Dimer-Grenzflächen des hexameren HERV-K-CA-Gitters gebildet werden (ergänzende Abbildung 5), sowie um die Intradomäne zu untersuchen Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Monomeren. Daher wurde ein erstes Modell, das für atomistische Simulationen geeignet ist, aus den Dichtedaten verfeinert, wie im Abschnitt „Methoden“ unten beschrieben und einem zuvor von Dick et al.33 entwickelten Verfahren gefolgt.

Aus den Simulationen wurden die quadratischen Mittelfluktuationen (RMSF) schwerer Atome abgeleitet, um die Flexibilität von Aminosäuren zu bestimmen, die sich an mehreren CA-Schnittstellen befinden. Wechselwirkungen zwischen Grenzflächenresten wurden auch durch Messung der Abstände von Rest zu Rest von der Simulationstrajektorie identifiziert. Insbesondere wurden Salzbrückenwechselwirkungen durch den Abstand zwischen wechselwirkenden Atomen charakterisiert, während für hydrophobe Wechselwirkungen der Schwerpunkt-zu-Schwerpunktabstand der schweren Seitenkettenatome gemessen wurde. Flexibilität ist ein guter Indikator für die Bedeutung und Spezifität von Kontakten, da starrere Kontakte tendenziell wichtiger für die Stabilität einer Grenzfläche sind, während flexiblere Reste gleichzeitig tendenziell breitere Wechselwirkungsdistanzverteilungen aufweisen, was auf schwankende Wechselwirkungen und geringere Besetzungen hinweist. Beispielsweise identifizierten wir zunächst R100 und Q118 (in h4) als die flexibelsten Reste an der Interhexamer-Trimer-Grenzfläche, die durch die höchsten RMSF-Werte gekennzeichnet sind (Abb. 3a – c). Aufgrund dieser Flexibilität bildete Q118 regelmäßig Wasserstoffbrückenbindungen mit R100 und interagierte gleichzeitig mit dem Lösungsmittel (Abb. 3a, ergänzende Abb. 6a). Darüber hinaus bildete R100 auch hydrophobe Wechselwirkungen mit S121 und T122 (Abb. 3a, ergänzende Abb. 6a). Wir haben die Wirkung der Ladungsunterdrückung durch Alaninmutation auf diese Reste getestet, indem wir die Effizienz der VLP-Produktion mithilfe von Western Blots gemessen haben. Diese Ergebnisse stimmten mit ihrer Fähigkeit überein, den Zusammenbau bei Mutation beizubehalten, und bewiesen, dass die chemische Natur dieser Reste für die Bildung der trimeren Grenzfläche nicht wesentlich ist (Abb. 3g).

a–c Schnappschüsse der Inter-Hexamer-Trimer-Schnittstelle, an der Helix 4 beteiligt ist, wobei die beteiligten Seitenketten als Stäbchen dargestellt sind. Die Reste in (b) und (c) zeigen stabile Wechselwirkungen. d Eine Momentaufnahme der Inter-Hexamer-Dimer-Schnittstelle, an der Helix 9 mit den beteiligten Seitenketten beteiligt ist. e, f Ansichten des 6HB mit den beitragenden Seitenketten des hydrophoben Kerns (M244 und I248) (e) und der K166- und K240-Ringe mit dem IP6-Molekül (f). In jedem Schnappschuss wird das Protein als Cartoon dargestellt (NTD in Blau, CTD in Orange). Die Aminosäureseitenketten sind basierend auf dem im Rahmen der MD-Simulation berechneten Schweratom-RMSF gefärbt. g Western-Blot der VLP-Anordnung, die Trimerschnittstellenmutanten von HERV-K Gag trägt. Die Western-Blot-Experimente, einschließlich unabhängiger Infektionen, wurden dreimal wiederholt. Quelldaten für (g) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Stabile Wechselwirkungen wurden an der trimeren Grenzfläche zwischen Hexamer gefunden, die von geladenen Resten dominiert und durch hydrophobe Reste in h4 ergänzt wird. Es wurde gezeigt, dass hydrophobe Wechselwirkungen an der Interhexamer-Trimer-Grenzfläche zwischen L82 und W87 für eine Stabilisierung der Trimer-Grenzfläche sorgen (Abb. 3c, ergänzende Abb. 6c). Eine genauere Untersuchung ergab, dass L82 untereinander und mit W87 unspezifische hydrophobe Cluster bildete (ergänzende Abbildung 6c). Die geladenen Reste R97, E69, K85 und D90 sowie der hydrophobe Rest Y66 wurden aufgrund ihrer niedrigen RMSF-Werte als nicht flexibel identifiziert (Abb. 3b). Dementsprechend ist ihre Dichte in der Kryo-ET-Karte im Vergleich zu flexiblen Resten in der Interhexamer-Trimer-Grenzfläche gut aufgelöst (ergänzende Abbildung 7). Wir stellten fest, dass R97 Salzbrücken-Wechselwirkungen mit E69 und Aminoaromaten-Wechselwirkungen mit Y66 bildete (Abb. 3b, ergänzende Abb. 6b); und K85 bildete eine Salzbrückenwechselwirkung mit D90 (Abb. 3b, ergänzende Abb. 6b). Die Ladungsentfernung von jedem dieser Reste einzeln sowie die Veränderung des aromatischen Rests führen zur vollständigen Abschaffung der VLP-Produktion (z. B. Mutationen zu Alanin) (Abb. 3g). Die Ergebnisse bestätigen die stabilisierende Rolle dieser Aminosäuren an der Inter-Hexamer-Trimer-Grenzfläche bei der Anordnung unreifer HERV-K-Gag.

An der Inter-Hexamer-Dimer-Grenzfläche konnten wir hydrophobe Wechselwirkungen zwischen h9 bestätigen, ähnlich wie bei anderen Retroviren. Im Durchschnitt waren Reste an der Interhexamer-Dimer-Grenzfläche im Vergleich zu Resten an der Inter-Hexamer-Trimer-Grenzfläche mit Ausnahme von L196 weniger flexibel (Abb. 3d, ergänzende Abb. 6d). Darüber hinaus interagierte V192 mit L196 und periodisch mit I193 oder M197 (ergänzende Abbildung 6e), was auf mögliche Teilbelegungen von V192 hinweist. Wir beobachteten auch, dass E135 Salzbrückenwechselwirkungen mit R98 bildete (ergänzende Abbildung 6f). Darüber hinaus beobachteten wir die durch Natriumionen vermittelte Bildung von Salzbrücken zwischen E132 benachbarter Hexameren (ergänzende Abbildung 6g), in Übereinstimmung mit Nicht-Protein-Dichtebereichen, die in der Kryo-ET-Karte in der Nähe der E132-Reste beobachtet wurden (ergänzende Abbildung). . 8).

Bei der Überwachung der Seitenkettenflexibilität bei den intrahexameren Wechselwirkungen bestätigten wir die schlechte Stabilität der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Ringen von M244 und I248 am 6HB (ergänzende Abbildung 6h). Dieser Mangel an Stabilität wurde durch ihre erhöhte Flexibilität im Vergleich zu K166 und K240 erfasst (Abb. 3e, f). Durch die Zugabe von IP6-Molekülen zum Hohlraum der hexameren Ringe wurden sowohl die K166- als auch die K240-Ringe durch die Bildung von Salzbrückenwechselwirkungen stabilisiert (ergänzende Abbildung 6i). Es wurde beobachtet, dass die K166- und K240-Ringe in Abwesenheit der IP6-Moleküle flexibler sind, was sich in erhöhten quadratischen Mittelabweichungen (RMSD) im Vergleich zu den Hexameren mit gebundenen IP6-Molekülen widerspiegelt (Abb. 3e, f, ergänzende Abb. 9). . Darüber hinaus erweist sich das IP6-Molekül im 6HB als stabil, gemessen an einem niedrigen RMSF in den Kohlenstoffringatomen, während die Sauerstoffatome in den Phosphorylgruppen entsprechend der beobachteten Dichte am flexibelsten sind (ergänzende Abbildung 10). .

Beim Vergleich der unreifen Form von HERV-K CA mit seinem reifen Gegenstück18 zeigt sich deutlich, dass NTD und CTD separat nahezu perfekt überlappen und sich die Anzahl der Helices und ihre Orientierungen in den separaten Domänen nicht ändern, mit Ausnahme der Hinzufügung von h12 in die unreife Struktur (Abb. 4a) (beachten Sie, dass die Nummerierung der Helices von Acton et al.18 abweicht, um mit anderen Retroviren übereinzustimmen, bei denen Helix 9 die CTD-CTD-Schnittstelle bildet). Allerdings nimmt das Gelenk zwischen den Domänen in der unreifen CA eine völlig andere Konformation als in der reifen Form an, was zu einer unterschiedlichen Ausrichtung zwischen NTD und CTD führt und folglich weder die dimeren noch die trimeren Schnittstellen gleich sind. Dies ist analog zu dem Konformationsunterschied, der zwischen der reifen und der unreifen CA bei HIV-119 beobachtet wird.

a Überlagerung der unreifen HERV-K-Struktur (NTD blau, CTD orange, h12 rot) mit reifem HERV-K (grau, PDB: 6SSM), getrennt nach NTD (links), CTD (Mitte) und NTD/CTD ausgerichtet (Rechts). b, c Anordnung der unreifen (b) und reifen (c) HERV-K-Gitter. NTD ist in Blau/Cyan, CTD in Orange/Rot gefärbt. d, e Detaillierte Ansichten der Dimer- (oben) und Trimer-Grenzfläche (unten) im unreifen (d) und reifen (e) Gitter.

Im unreifen Gitter liegen NTD und CTD übereinander, was es unmöglich macht, Wechselwirkungen zwischen den beiden Domänen auszubilden. Dadurch erhält es ein engeres, vertikal gestreckteres Packungsschema als das ausgereifte Gitter (Abb. 4d, e). Die dichte Packung ermöglicht es dem Virus, einen völlig neuen Satz von Wechselwirkungen in seinem Gitter zu bilden, einschließlich der 6HB- (Abb. 4b), der Dimer-Grenzfläche und der Trimer-Grenzfläche (Abb. 4b – e). Die Dimerschnittstelle im unreifen HERV-K ist der von M-PMV sehr ähnlich, im Vergleich zu HIV-1 jedoch umfangreicher, insbesondere unter Beteiligung des NTD19. Wie HIV-1 werden die HERV-K-dimeren CTD-CTD-Wechselwirkungen durch Helix 9 sowohl in der unreifen als auch in der reifen Struktur gebildet. Während einige der interagierenden Seitenketten, A189, V192 und I193, erhalten bleiben18, sind die Kreuzungswinkel von h9 jedoch sehr unterschiedlich (–50° unreif vs. 95° reif), was insgesamt zu einer anderen Grenzfläche führt. Die Ähnlichkeit zwischen HERV-K und HIV-1 in den unreifen Schnittstellen und im Konformationsunterschied zwischen der reifen und der unreifen CA lässt auf einen wahrscheinlich konservierten strukturellen Reifungsprozess schließen34,35.

Strukturell ist die Anordnung der CA-Domänen im intakten unreifen HERV-K dem unreifen M-PMV und RSV am ähnlichsten, weicht jedoch von unreifem HIV-1 und MLV ab (Abb. 5a). Ein solcher Unterschied in der Ausrichtung der CA-Domäne wurde bereits zwischen M-PMV und HIV-119 festgestellt. Beim Vergleich von HERV-K mit HIV-1 sind die Sequenzen der terminalen Helices in HIV-1 und HERV-K auffallend ähnlich (ergänzende Abbildung 11). HERV-K und HIV-1 binden beide IP6 über zwei Lysinringe19 (Abb. 5d). RSV, ein Alpharetrovirus, bindet IP6 in einer ähnlichen Tasche, jedoch über einen Ring aus Lysinen und einen Ring aus Argininen20. Während HERV-K, HIV-1, MLV und M-PMV alle ihre Helix 9 nutzen, um eine dimere Schnittstelle im CTD zu bilden, bildet MLV zusätzliche Wechselwirkungen zwischen seiner 3/10-Helix und der Basis von h936. Andere Retroviren nutzen zusätzliche dimere Schnittstellen in der NTD, so dass MLV Helix 7 und die Schleife zwischen Helix 4 und 536 umfasst, RSV seine dimere Schnittstelle mithilfe der Helices 2 und 7 bildet und seine stromaufwärts gelegene Region p10 benötigt, um das CA-Gitter zu bilden37, während HIV- 1 erfordert H1/H2 zur Bildung der dimeren/trimeren Schnittstellen im NTD29.

a Überlagerung der unreifen CA-Monomerstrukturen von HERV-K (NTD blau, CTD orange, h12 rot) mit denen anderer Retroviren (grau), die an NTD ausgerichtet sind, dargestellt sind M-PMV (PDB: 6HWI, Beta-Retrovirus), RSV (PDB: 5A9E, Alpha-Retrovirus), HIV-1 (PDB: 7ASL, Lentivirus), MLV (PDB: 6HWW, Gamma-Retrovirus). b Hexamerstrukturen von M-PMV, RSV, HIV-1 und MLV. c Strukturbasierter phylogenetischer Baum. d–f Konservierung unreifer intermolekularer CA-Schnittstellen im Vergleich zu HIV-1 (Hexamer-Schnittstelle, d), RSV (Trimer-Schnittstelle, e) und MLV (Dimer-Schnittstelle, f). Die HERV-K-Struktur ist in Blau und Orange gefärbt, andere Retroviren in Grau.

Ein strukturbasierter phylogenetischer Baum kann verwendet werden, um Proteinmodelle nach ihrer Ähnlichkeit zu sortieren, ohne ihre Aminosäuresequenz zu berücksichtigen. Dies ermöglicht Vergleiche, die nicht davon abhängen, wie eng die beiden Viren miteinander verwandt sind. Ein Baum, der auf veröffentlichten unreifen Strukturen basiert, ermöglicht es uns, Ähnlichkeiten zu erkennen, die sonst nicht offensichtlich wären (Abb. 5c). Ein Vergleich mit dem reifen HERV-K-CA kann erklären, warum es am weitesten von seiner unreifen Form entfernt ist, obwohl es offensichtlich die gleiche Aminosäuresequenz wie seine unreife Form aufweist.

Überraschenderweise befindet sich das unreife Betaretrovirus M-PMV jedoch nicht neben dem unreifen HERV-K-Modell. Es hat eine ähnliche NTD wie HERV-K, was sich in der Ähnlichkeit der trimeren Schnittstelle zeigt. Allerdings unterscheiden sich seine Helices im CTD deutlich; und wie bereits besprochen fehlt ihm die h12-Helix am C-Terminus, die in den anderen Retroviren das 6HB bildet (Abb. 5b). Es ist erwähnenswert, dass MPMV ein Betaretrovirus vom Typ D ist, das sich von MMTV und anderen Betaretroviren unterscheidet. RSV, ein Alpharetrovirus, hat die engste Verwandtschaft mit HERV-K. Tatsächlich überlappt es in beiden Domänen gut und auch seine trimere Grenzfläche wird auf ähnliche Weise gebildet (Abb. 5e). Trotz dieser Ähnlichkeiten unterscheiden sich die quartären Anordnungen der beiden Viren, einschließlich des 6HB. MLV befindet sich am anderen Ende des Baums, was dadurch erklärt werden kann, dass es weder seine CTD noch seine NTD gut überlappt (Abb. 5a). Die entfernte Verwandtschaft von MLV wurde auch beim Vergleich reifer Formen charakterisiert18. Interessanterweise bleiben bei allen unreifen Retroviren die dimeren Schnittstellen konserviert, selbst im Vergleich zum entfernten MLV (Abb. 5f).

Die Untersuchung der Struktur eines endogenen Virus liefert Einblicke in die Architektur endogener Viren bei ihrer Integration in das Genom. HERV-K gilt als junges endogenes Virus, da einige Kopien vor <1 Million Jahren integriert wurden38. Ein Vergleich der HERV-K-CA-Struktur mit denen exogener Viren zeigt, wie unterschiedlich sie sind. Da hier jedoch die Konsensussequenz von HERV-K verwendet wird, die eine Annäherung an die HERV-K-Gruppe darstellt, könnten geringfügige Abweichungen möglich sein, insbesondere wenn man bedenkt, dass die endogenisierten Viren möglicherweise aus einer Auswahl von Ausreißern entstanden sind, die anfälliger für Endogenisierung sind . Dennoch bleibt die insgesamt unausgereifte Virenarchitektur erhalten. Interessanterweise wird ein kleines Wirtsmolekül rekrutiert, um den Zusammenbau von unreifem HERV-K auf die gleiche Weise wie die anderen Retroviren zu unterstützen, was auf ein Kennzeichen unreifer Retroviren über Gattungen und Evolutionszeiten hinweg hindeutet. Die offensichtliche Strukturkonservierung bestärkt den Hinweis, dass die Montage- und Reifungsprozesse bei Retroviren ähnliche Mechanismen beinhalten.

Der Konsensus des HERV-K-gag/pol-Gens HERV-Gag-PR-Pol11 wurde freundlicherweise von Paul Bieniasz zur Verfügung gestellt. Transfektionen wurden in HEK293T-Zellen (ECACC) mit dem Konsensus-HERV-K-Gag-Plasmid unter Verwendung von GeneJet als Gefäß durchgeführt. Die VLPs wurden 48 Stunden nach der Transfektion durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit und Filtern des Überstands zur Entfernung großer Zelltrümmer geerntet. Der Überstand wurde dann mit 8 % OptiPrep (Sigma-Aldrich) in STE-Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA; Sigma-Aldrich) als Kissen unterlegt und bei 100.000 g, 4° zentrifugiert C für 1:20 h. Das Pellet wurde 2:30 Stunden lang bei 120.000 g und 4 °C auf 10 %, 20 % und 30 % OptiPrep-Gradienten geschleudert. Die VLP-Banden wurden mit einer Spritze extrahiert und erneut in STE bei 160.000 g und 4 °C für 1:20 Stunden pelletiert, um restliches OptiPrep zu entfernen. Anschließend wurde das Pellet in der Restflüssigkeit resuspendiert.

VLPs wurden mit 6-nm-Gold-Referenzmarken gemischt. Das Tauchgefrieren wurde mit einem Leica GP2 durch Blotting von der Nicht-Kohlenstoff-Seite aus durchgeführt. Die Probe wurde auf Spitzenkohlenstoffgitter, 300 Mesh Cu (Agar Scientific), aufgetragen, 3 Sekunden lang geblottet und in flüssiges Ethan getaucht. Gitter wurden auf einer Talos Arctica gescreent.

Die Datenerfassung erfolgte auf einem Titan Krios, ausgestattet mit einem Selectris-Energiefilter (Thermo Fisher Scientific). Die Pixelgröße wurde auf 1,5 Å, die Belichtung auf 1,17 s, eine Gesamtdosis von 127,5 Elektronen/Å2 und eine Spaltbreite von 5 eV eingestellt. Die Neigungsreihen wurden mit einem dosissymmetrischen Neigungsschema unter Verwendung eines Bereichs von +/–60° und einer Schrittgröße von 3° erfasst.

124 Neigungsserien wurden mithilfe automatisierter Routinen, die im IMOD-Paket implementiert sind, ausgerichtet und rekonstruiert39. Astigmatische Per-Tilt-CTF-Modelle wurden anhand geometrischer Parameter geschätzt, die aus dem Tilt-Serien-Ausrichtungsprozess erhalten wurden40. Um die Positionen auszuwählen, die dem Gag-Protein entsprechen, wurden VLPs zunächst manuell aus jedem Tomogramm in 3D ausgewählt. Der Radius jedes VLP wurde geschätzt und zusammen mit seinen xyz-Mittelkoordinaten gespeichert. Die Volumensegmentierung entlang des CA-Gitters niedriger Dichte wurde halbautomatisch unter Verwendung minimaler geodätischer Oberflächen durchgeführt41,42. Es wurden gleichmäßig verteilte Positionen entlang des CA-Gitters erzeugt, wobei ein Mindestabstand zwischen den Einheiten von 96 Å eingehalten wurde. Mit dieser Strategie wurden 274.994 Partikelpositionen aus der Segmentierung von 794 VLPs ausgewählt und entsprechende Teilvolumina für die weitere Analyse extrahiert. Die Ab-initio-Mittelung des Teilvolumens erfolgte mit EMAN243, gefolgt von einer hochauflösenden Verfeinerung mittels eingeschränkter Einzelpartikeltomographie (CSPT)40,44. Nach mehreren Runden der Partikelorientierung und Verfeinerung der Neigungsgeometrie wurden minderwertige und doppelte Partikel entfernt, was zu 188.111 sauberen Partikeln führte, die zur endgültigen Rekonstruktion von unreifem Gag mit einer Auflösung von 3,2 Å verwendet wurden. Die Auflösung wurde mithilfe der Half-Map-Fourier-Shell-Korrelation (FSC) unter Verwendung der Cutoff-Kriterien von 0,143 geschätzt. Die endgültige EM-Karte und die Atomkoordinaten wurden mit dem ArtiaX-Plugin45 mit den während der CSPT-Verfeinerung erhaltenen Partikelorientierungen42 wieder in die Tomogramme abgebildet.

Wir haben vor MD-Simulationen ein Strukturmodell des HERV-K-CA-Hexamers durch vergleichende Modellierung mit RosettaCM32 gemäß dem folgenden Verfahren erstellt und verfeinert.

Zuerst wurde die CryoET-STA-Struktur des HERV-K-CA-Hexamers mithilfe der UCSF Chimera46-Softwareversion 1.17 separat in die Dichte eingepasst, indem eine anfängliche grobe simulierte Dichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å erstellt, in die experimentelle CryoET-Dichte eingepasst und dann angepasst wurde Erhöhen Sie nacheinander die Auflösung der simulierten Dichtekarte auf 4 Å und 2 Å und passen Sie sie dann erneut an. Darüber hinaus wurde die experimentelle KryoET-Dichte innerhalb von 2 Å des HERV-K-CA-Hexamers ausgewählt und zur Strukturverfeinerung verwendet. Darüber hinaus wurde ein angepasstes CA-Monomer aus der angepassten Struktur extrahiert und als Vorlage für die dichtegesteuerte Vergleichsmodellierung verwendet.

Als nächstes wurde die HERV-K-CA-Aminosäuresequenz in das Matrizenmonomer eingefädelt. Darüber hinaus wurden sechs Ketten des Gewindemodells wieder in die Hexamer-KryoET-Dichte eingepasst und zur Erzeugung von Symmetriedefinitionen für die Verwendung in Rosetta verwendet, wobei benachbarte Ketten eingeschränkt wurden, um eine C6-NCS-Symmetrie aufrechtzuerhalten.

RosettaCM wurde dann verwendet, um das Modell mithilfe der CryoET-Dichte zu verfeinern, indem drei Optimierungsschritte durchgeführt wurden: Zunächst wurden De-novo-Strukturen für fehlende Schleifen generiert und im Torsionswinkel und im kartesischen Koordinatenraum mittels Monte-Carlo-Probenahme optimiert. Zweitens wurden die erzeugten Schleifen mit den aus dem Template-Modell entnommenen Strukturen verbunden, indem eine Monte-Carlo-Probenahme im kartesischen Koordinatenraum durchgeführt wurde, wodurch die Rückgratgeometrie und die Rückgrat-Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen optimiert wurden. Im letzten Schritt wurden die Seitenketten der Gesamtstruktur geometrisch im kartesischen Koordinatenraum optimiert, indem die Rosetta-Energiefunktion für alle Atome minimiert wurde. In den drei Schritten wurde der Dichtebewertungsterm elec_dens_fast mit Gewichten von 10, 10 bzw. 50 verwendet. Darüber hinaus wurde in allen Schritten eine symmetrische Bewertung und Optimierung ermöglicht. Die letzte Bewertungsfunktion für die Dichte aller Atome verwendete die Gewichte von talos_2014. Die drei Optimierungsschritte wurden in einem einzigen Verfahren mithilfe des Hybridizer-Movers in der Rosetta-Skriptversion 2021.16.61620 durchgeführt.

Insgesamt haben wir mit diesem Verfahren unabhängig voneinander 800 Modelle generiert und das Topmodell mit der niedrigsten potenziellen Energie, gemessen durch Rosettas Gesamtatomenergiefunktion47, wurde als Ausgangsstruktur für MD-Simulationen ausgewählt.

Die Qualität der verfeinerten Struktur wurde mithilfe des MolProbity48-Servers quantifiziert, der die strukturelle Konsistenz der Bindungen, Winkel, Dieder und Rotamere einer Proteinstruktur im Vergleich zu ihren experimentell erwarteten Werten49,50 bewertet. Obwohl die unverfeinerte Ausgangsstruktur zahlreiche sterische Zusammenstöße mit Atomen in Abständen von weniger als 0,4 Å sowie Ausreißerkonformationen für die Bindungen, Winkel, Dieder und Rotamere enthielt, ermöglicht uns die geometrische Verfeinerung sowohl im kartesischen als auch im Torsionswinkelraum, eine Struktur mit zu erhalten minimale Konflikte, Erhöhung des Prozentsatzes bevorzugter Dieder und Rotamere und Verringerung der Anzahl struktureller Ausreißer bei gleichzeitiger Erhaltung der gesamten Sekundärstruktur und Übereinstimmung mit der KryoET-Dichte. Infolgedessen erreicht unser verfeinertes Modell einen niedrigeren MolProbity-Score, wie in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst, und passt gut in die durch Q-Scores51 berechnete Dichte (ergänzende Abbildung 12). Das resultierende Modell ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.

Als Ausgangsmodell für MD-Simulationen wurde das Atommodell des HERV-K-CA-Hexamers verwendet, das mit der Rosetta-Software basierend auf der KryoET-Dichte erstellt wurde (ergänzende Abbildung 5a). Das modellierte CA-Hexamer wurde verwendet, um ein Hexamer-Hexamer-Motiv (HOH) (sechs Hexamer um ein zentrales Hexamer) zu erzeugen, indem jedes modellierte Hexamer mithilfe der UCSF-Chimera-Software in die KryoET-Dichte eingepasst wurde (ergänzende Abbildung 5b). Wir haben die IP6-Moleküle zwischen Lys166- und Lys240-Ringen in jedem Hexamer angedockt, indem wir das in der UCSF Chimera-Software implementierte Autodock Vina52-Tool verwendet haben. Wir haben einhundert Chloridionen und fünfzig Natriumionen in der Nähe der Hexamer platziert, indem wir das Cionize-Plugin in der VMD-Software53, Version 1.9.4a57, verwendet haben. Darüber hinaus haben wir das resultierende System mit TIP3P-Wassermolekülen solvatisiert und zusätzliche Natrium- und Chloridionen hinzugefügt, um mithilfe des Autoionisierungs-Plugins in VMD53 eine Salzkonzentration von 150 mM zu erreichen (ergänzende Abbildung 5c). Somit verfügte das vorbereitete HOH-Modell mit Lösungsmittel über eine alle Atome auflösende Granilarität, die erforderlich war, um die Stabilität der Struktur auf Restebene zu quantifizieren und elektrostatische, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen zu identifizieren. Die endgültige Simulationsdomäne enthielt ≈1.250.000 Atome mit einer Gesamtsystemgröße von ≈312 Å × 303 Å × 140 Å. Ein System ohne IP6-Moleküle wurde nach demselben Setup-Protokoll generiert und hatte eine ähnliche Systemgröße wie in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Wir haben die resultierenden HOH-Simulationsdomänen in Gegenwart und Abwesenheit von IP6-Molekülen demselben Simulationsprotokoll unterzogen. Zunächst wurden die Simulationsdomänen einer Minimierung in zwei Schritten mit der Simulationssoftware NAMD2.14 unterzogen55. Im ersten Minimierungsschritt fixierten wir das Protein und die IP6-Moleküle, während die Energie der Lösungsmittelmoleküle mithilfe des konjugierten Gradientenschemas minimiert wurde, bis der Gradient Werte unter 10 kcal mol-1 Å-1 erreichte. Im zweiten Schritt wurden Beschränkungen des Proteins und der IP6-Moleküle aufgehoben und die Energie des gesamten Systems mithilfe des konjugierten Gradientenschemas für 100.000 Schritte minimiert. Auf jeden Minimierungsschritt folgte eine Thermalisierung des Simulationsbereichs, bei der das System in Schritten von 5 K über 0,5 ns von 50 K auf 310 K erhitzt wurde. Während des zweiten Thermalisierungsschritts wendeten wir die Positionsbeschränkungen auf die schweren Rückgratatome der Hexamere und auf die schweren Atome der IP6-Moleküle mit einer Kraftkonstante von 10 kcal mol-1 Å-1 an. Anschließend führten wir Molekulardynamiksimulationen durch, bei denen die Positionsbeschränkungen schrittweise mit einer Geschwindigkeit von 1 kcal mol-1 Å-1 pro 0,2 ns von 10 kcal mol-1 Å-1 auf 0 kcal mol-1 Å-1 über 2 entfernt wurden ns. Anschließend wurden die Systeme für 2 ns äquilibriert. Wir haben die beiden letztgenannten Simulationen im NPT-Ensemble durchgeführt, während die Temperatur mit dem Langevin-Thermostat bei 310 K mit einer Kopplungskonstante von 1 ps-1 gehalten wurde und der Druck bei 1 atm gehalten wurde, wobei die Perioden- und Abklingparameter auf 100 ps und 50 eingestellt waren ps bzw. mit dem Nose-Hoover-Barostat. Während der Äquilibrierungssimulationen wurden die Gitterkräfte56,57 aktiviert, um die gesamte HOH-Anordnung aufrechtzuerhalten und die Diffusion der einzelnen Monomere in das Lösungsmittel mithilfe der experimentellen KryoET-Dichte zu verhindern.

Nachdem wir die Äquilibrierung der Simulationsdomänen durchgeführt hatten, führten wir Produktionssimulationen der HOH-Systeme durch. Wir haben die Positionsbeschränkungen von 1 kcal mol-1 Å-1 auf die Cα-Atome im Proteinrückgrat der helikalen Segmente in jedem Hexamer angewendet. In allen Simulationen wurden periodische Randbedingungen mit einem Zeitschritt von 2 fs verwendet. Die elektrostatischen Wechselwirkungen wurden unter Verwendung der Partikelnetz-Ewald-Methode berechnet, wobei der Grenzwert für elektrostatische Wechselwirkungen im Nahbereich auf 12 Å eingestellt wurde. Wir haben alle Simulationen mit dem CHARMM36m58-Kraftfeld für Proteine durchgeführt, die Kraftfeldparameter für IP6 wurden mit CGenFF59,60, den Roux-Kraftfeldparametern für Ionen61 und dem TIP3P-Wassermodell54 generiert. Wir haben für jedes HOH-System in Gegenwart und Abwesenheit der IP6-Moleküle Daten im Wert von 200 ns generiert.

Wir analysierten die Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren an den Trimer- und Dimer-Grenzflächen, die durch die benachbarten Hexamere gebildet werden, sowie die Wechselwirkungen innerhalb der Domäne. Für Reste an Inter-Hexamer-Dimer-Grenzflächen und Inter-Hexamer-Trimer-Grenzflächen wurden ihre quadratischen Mittelwertschwankungen und Kontakte mit anderen Resten an der Grenzfläche über alle 12 Dimer-Grenzflächen bzw. 6 Trimer-Grenzflächen erfasst, während Wechselwirkungsabstände und quadratische Mittelwertschwankungen erfasst wurden Für Intra-Hexamer-Schnittstellenreste wurden alle 7 Hexamer-Einheiten in der HOH-Anordnung gesammelt. Die angegebenen Werte sind statistische Durchschnittswerte über alle Kopien eines Rests in einer bestimmten Schnittstelle und daher Durchschnittswerte über unabhängige Replikate mit unterschiedlichen Anfangskoordinaten. Hydrophobe Wechselwirkungen wurden erfasst, indem die Abstände von Schwerpunkt zu Schwerpunkt zwischen den schweren Atomen der interagierenden Aminosäureseitenketten berechnet wurden, während Salzbrückenwechselwirkungen als Abstände zwischen den interagierenden Atomen definiert wurden.

Mutationen wurden eingeführt, indem Vorwärts- und Rückwärtsprimer entworfen wurden, die die gewünschte Mutation enthielten, und dann eine PCR mit Pfr Turbo durchgeführt und das ursprüngliche Plasmid mit DpnI bei 37 °C eingeschränkt wurde. Primersequenzen werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Die Mutationen wurden durch Sequenzierung bestätigt (Forward-Primer: TCAAGAAAGGAAGGAGATACTGAG). Die Transfektionen wurden wie im Abschnitt „VLP-Vorbereitung“ erläutert durchgeführt, jedoch mit 10x weniger Zellen zu Beginn. Als Positivkontrolle wurde das HERV-Kcon-Plasmid verwendet und für die Negativkontrolle wurde kein Plasmid verwendet. Der Überstand wurde bei niedriger Geschwindigkeit abzentrifugiert, filtriert und 1 Stunde lang bei 150.000 g auf ein 8 %iges OptiPrep-Kissen pelletiert. Der Überstand wurde auf einem SDS-Gel laufen gelassen und dann auf eine Membran übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch blockiert und dann mit dem primären HERV-K-Gag-Antikörper (1:5000-Verdünnung, HERM-1841-5) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Membran wurde vor der Inkubation mit dem sekundären Anti-Maus-HRP-Antikörper (1:5000-Verdünnung, A0168 Sigma-Aldrich) eine Stunde lang bei RT gewaschen und mit den Clarify Western ECL-Substratlösungen (Bio-Rad) abgebildet. Ein Beispiel für vollständige Scan-Blots finden Sie in der beigefügten Quelldatendatei.

Der strukturbasierte phylogenetische Baum wurde mit SHP62,63 erstellt, wie in64 angegeben. Die folgenden PDB-Dateien wurden verwendet: 6SSM (HERV-K reif)18, 7ASL (HIV-1 unreif)30, 6HWW (MLV unreif)36, 6HWI (M-PMV unreif)36, 5A9E (RSV unreif)37, dieser HERV -K unreifes Modell. Wenn die PDB-Dateien mehr als eine Kette enthielten, wurde nur ein Monomer verwendet und die Monomere wurden in Chimera vorab ausgerichtet, um sie vor der Ausführung von SHP in dasselbe Koordinatensystem zu bringen. Das Aminosäuresequenz-Alignment wurde mit dem Online-Tool Clustal Omega und die Aminosäurefärbung mit MView65 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen im Papier erforderlichen Daten sind im Papier enthalten und/oder die ergänzenden Informationen und Quelldaten werden mit diesem Papier bereitgestellt. Die kryoET-Subtomogramm-Mittelungsdichtekarten und die entsprechenden Atommodelle wurden in der EMDB und PDB mit den Zugangscodes EMD-16511 bzw. PDB-ID 8C9M hinterlegt. PDB-Codes zuvor veröffentlichter Strukturen, die in dieser Studie verwendet werden, sind 6SSM (HERV-K reif), 7ASL (HIV-1 unreif), 6HWW (MLV unreif), 6HWI (M-PMV unreif) und 5A9E (RSV unreif). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle zur Modellverfeinerung und Molekulardynamiksimulation verwendeten Eingabedateien und Skripte sowie die Anfangs- und Endkoordinaten der analysierten Flugbahn wurden im öffentlichen Repository Zenodo [https://doi.org/10.5281/zenodo.8180645] hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Paul Bieniasz für das pCRVI/Gag-PR-Pol-Plasmid, Geoff Sutton und Weng Ng für ihre Hilfe bei der strukturbasierten phylogenetischen Baumdarstellung. Wir danken Luiza Mendonca für ihre Hilfe bei der ersten VLP-Vorbereitung. Wir danken Diamond für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im britischen National Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) (Vorschläge NT21004 und NR21005), finanziert vom Wellcome Trust, MRC und BBSRC. Die Datenverarbeitungsaspekte dieser Forschung wurden durch den Wellcome Trust Core Award Grant Nummer 203141/Z/16/Z und das NIHR Oxford BRC unterstützt. Wir bedanken uns für die rechnerische Unterstützung durch die folgenden Ressourcen: das Delaware Advanced Research Workforce and Innovation Network (DARWIN) und den Caviness-Cluster. Diese Studie nutzte die von Duke Research Computing (http://rc.duke.edu) angebotenen Rechenressourcen. Wir danken Tracy Futhey, Katie Kilroy, Charley Kneifel, Mike Newton, Victor Orlikowski, Tom Milledge und David Lane vom Duke Office of Information Technology and Research Computing für die Unterstützung bei der Computerumgebung. Diese Forschung wurde durch den UK Wellcome Trust Investigator Award (206422/Z/17/Z) und den ERC AdG Grant (101021133) finanziert, ASK wurde durch ein Wellcome Trust Cellular Structural Biology Dphil Studentship unterstützt. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse wurden teilweise von NIAID und NIGMS der National Institutes of Health (R01AI157843 und R01GM141223) unterstützt. Diese Arbeit nutzte Delta am National Center for Supercomputer Applications durch die Zuteilung MCB170096 aus dem Advanced Cyberinfrastructure Coordination Ecosystem: Services & Support (ACCESS)-Programm, das durch die Zuschüsse der National Science Foundation #2138259, #2138286, #2138307, #2137603 und unterstützt wird #2138296.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Anna-Sophia Krebs, Hsuan-Fu Liu, Ye Zhou.

Abteilung für Strukturbiologie, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Universität Oxford, Oxford, OX3 7BN, Großbritannien

Anna-Sophia Krebs, Juan Shen & Peijun Zhang

Abteilung für Biochemie, Duke University School of Medicine, Durham, NC, 27710, USA

Hsuan-Fu Liu & Alberto Bartesaghi

Institut für Informatik, Duke University, Durham, NC, 27708, USA

Ye Zhou und Alberto Bartesaghi

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Delaware, Newark, DE, 19716, USA

Juan S. Rey, Lev Levintov und Juan R. Perilla

Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, OX11 0DE, Großbritannien

Andrew Howe & Peijun Zhang

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, Duke University, Durham, NC, 27708, USA

Alberto Bartesaghi

Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Oxford Institute, Universität Oxford, Oxford, OX3 7BN, Großbritannien

Peijun Zhang

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ASK und PZ konzipierten Projekt. ASK produzierte und reinigte HERV-K-VLPs, bereitete die KryoET-Probe mit Hilfe von JSAH vor und sammelte die Daten der Tomographie-Neigungsserie. HFL und YZ führten die Subtomogramm-Mittelung durch. JSR, LL und JRP erstellten die Molekulardynamiksimulationen. ASK und PZ analysierten die HERV-K-Struktur. ASK, LL, JSR, JRP, AB und PZ haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Juan R. Perilla, Alberto Bartesaghi oder Peijun Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Eric May, Wah Chiu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krebs, AS., Liu, HF., Zhou, Y. et al. Molekulare Architektur und Konservierung eines unreifen menschlichen endogenen Retrovirus. Nat Commun 14, 5149 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40786-w

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Eingegangen: 14. Januar 2023

Angenommen: 09. August 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40786-w

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