Mikrobe

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die durch kleine RNA (sRNA) vermittelte Trans-Königreich-RNA-Interferenz (RNAi) zwischen Wirt und Krankheitserreger wurde nachgewiesen und genutzt. Interspezies-RNAi in rhizosphärischen Mikroorganismen ist jedoch weiterhin unklar. In dieser Studie haben wir eine mikrobeninduzierte Gen-Silencing-Technologie (MIGS) entwickelt, indem wir einen rhizosphärischen nützlichen Pilz, Trichoderma harzianum, verwendet haben, um einen RNAi-Engineering-Mikroorganismus und zwei im Boden vorkommende pathogene Pilze, Verticillium dahliae und Fusarium oxysporum, als RNAi-Empfänger zu nutzen. Wir haben erstmals festgestellt, dass MIGS die GFP-Stummschaltung bei V. dahliae herbeiführen kann. Indem wir dann auf ein essentielles Pilzgen abzielten, konnten wir die Wirksamkeit von MIGS bei der Hemmung des Pilzwachstums und beim Schutz zweikeimblättriger Baumwoll- und einkeimblättriger Reispflanzen vor V. dahliae und F. oxysporum weiter nachweisen. Wir zeigten auch eine steuerbare MIGS-Spezifität basierend auf einer ausgewählten Zielsequenz. Unsere Daten bestätigen die artenübergreifende RNAi in rhizosphärischen Pilzen und die mögliche Anwendung von MIGS im Pflanzenschutz. Darüber hinaus wäre die In-situ-Vermehrung einer rhizosphärischen nützlichen Mikrobe optimal, um die Stabilität und Nachhaltigkeit von sRNAs sicherzustellen und die Verwendung von Nanomaterialien zum Transport chemisch synthetischer sRNAs zu vermeiden. Unser Befund zeigt, dass der Einsatz von MIGS-basierten Biofungiziden ein einfaches Design und eine einfache Implementierung ohne die Notwendigkeit einer genetischen Veränderung des Wirts für den Pflanzenschutz gegen Phytopathogene ermöglichen würde.

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Die in dieser Studie generierten sRNA-Sequenzdaten wurden in der Datenbank des Genome Sequence Archive (GSA) unter der Zugangsnummer CRA011970 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Z.-D. Jiang von der Abteilung für Pflanzenpathologie der South China Agricultural University für F. oxysporum-Stämme. Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Science Foundation of China (Zuschuss 32230003) und des Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Zuschuss Nr. XDA28030502) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Han-Guang Wen, Jian-Hua Zhao.

Staatliches Schlüssellabor für Pflanzengenomik, Institut für Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Han-Guang Wen, Jian-Hua Zhao, Bo-Sen Zhang, Feng Gao, Xue-Ming Wu, Yong-Sheng Yan, Jie Zhang und Hui-Shan Guo

CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Han-Guang Wen, Jian-Hua Zhao, Bo-Sen Zhang, Feng Gao, Xue-Ming Wu, Jie Zhang und Hui-Shan Guo

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H.-SG, J.-HZ und H.-GW haben Experimente entworfen. H.-GW, J.-HZ, B.-SZ und X.-MW führten Experimente durch. FG, Y.-SY und JZ leisteten technische Unterstützung. H.-SG, J.-HZ und H.-GW analysierten die Daten und diskutierten die Ergebnisse. H.-SG und J.-HZ haben den Artikel verfasst.

Korrespondenz mit Jian-Hua Zhao oder Hui-Shan Guo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Roger Innes, Maria Ladera-Carmona und Abdelhak El Amrani für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Schematische Beschreibung für die Erzeugung eines Inverted-Repeat-RNAi-Konstrukts. (b) Nachweis von Th-GFPi-Transformanten durch Sourthen-Blotting. Genomische DNA wurde wie angegeben durch Restriktionsenzyme verdaut. Als Sonde wurde die in [(a)] angegebene Promotorsequenz verwendet. (c) Nachweis von Th-GFPi-generierten siGFPs durch Northern Blot. Als Sonden wurden am 3'-Ende mit Biotin markierte GFP-spezifische Oligonukleotide verwendet. U6 wurde als Ladekontrolle erkannt. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. (d) Die Th-GFPi-Stämme zeigten eine normale Kolonie- und Hyphenmorphologie ähnlich der von Th. Maßstabsbalken: 10 μm. Die Experimente in (b), (c) und (d) wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

(a) Die Deletion jedes VdPMT-Gens in V592 und die Komplementierung von VdPMT2 in VdΔpmt2 wurden durch Southern Blot bestätigt. Genomische DNA wurde wie angegeben durch Restriktionsenzyme verdaut. Als Sonden wurden genspezifische Sequenzen verwendet. Restriktionsenzymstellen sind in den schematischen Diagrammen gekennzeichnet. Zum Nachweis der Transkripte in entsprechenden Mutantenstämmen wurde eine semiquantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR) verwendet. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. (b) Bewertung der Krankheitsgrade von Baumwollpflanzen, die mit V592, VdΔpmt2 und dem Komplementationsstamm VdΔpmt2/PMT2 infiziert sind, bei 21 dpi. Krankheitssymptome von Baumwollpflanzen sind in Abb. 2b dargestellt. Die Krankheitsgrade auf Baumwollblättern wurden in fünf Schweregrade der Krankheitssymptome während des Pilzbefalls eingeteilt: 0 = keine sichtbaren Welke- oder Vergilbungssymptome, 1 = ein oder zwei Keimblätter verwelkt oder abgefallen, 2 und 3 = ein oder zwei echte Blätter verwelkt oder abgefallen, 4 = alle Blätter abgefallen oder die ganze Pflanze ist abgestorben. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 9 Topfpflanzen dargestellt.

Quelldaten

(a) Schematische Beschreibung zur Generierung von Pmt2i-Konstrukten. (b) Nachweis von Th-Pmt2i-Transformanten durch Southern Blot. Genomische DNA wurde wie angegeben durch die Restriktionsenzyme verdaut. Als Sonde wurde die Promotorsequenz (in Extended Data Abb. 1a angegeben) verwendet. Restriktionsenzymstellen sind im schematischen Diagramm gekennzeichnet. (c) Th-Pmt2i-Stämme zeigten eine normale Kolonie- und Hyphenmorphologie ähnlich wie Th. Maßstabsbalken: 10 μm. (d) VdAGO-Proteine ​​sind für das Th-Pmt2i-inhibierte V592-Wachstum nicht erforderlich. Hemmzonen wurden für Th-Pmt2i entweder auf der Einzeldeletionsmutante VdΔago1 oder VdΔago2 oder auf der Doppeldeletionsmutante VdΔago1/2 beobachtet. (e) Nachweis der Doppeldelektionsmutante VdΔago1/2 durch Southern Blot. VdAGO1 wurde in VdΔago2 weiter gelöscht. Genomische DNA wurde wie angegeben durch Restriktionsenzyme verdaut. Als Sonde wurde die spezifische Sequenz des Resistenzscreening-Gens NAT verwendet. Restriktionsenzymstellen sind im schematischen Diagramm gekennzeichnet. RT-PCR wurde verwendet, um die Transkripte in entsprechenden Mutantenstämmen nachzuweisen. (f) Originalabbildung der qPCR-Kurven. Die zur Amplifikation der V592-spezifischen (V) und der pilzlichen ITS-Region (F) verwendeten Primer wurden in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Bodenproben und Zeitpunkte werden in verschiedenen Farbkurven dargestellt. Es wurden mindestens drei biologische Replikate durchgeführt und die repräsentativen Kurven präsentiert. Die Prozentsätze von V zu F (V/F), die die relative Biomasse von V592 in den gesamten Pilzen darstellen, sind in Abb. 3c dargestellt. (g) TEM-Bild extrazellulärer Partikel aus dem Kulturüberstand von Th-Pmt2i−1. Die Experimente in (b)–(g) wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

(a) Wirkung von Th-Pmt2i−1 auf den Baumwollschutz gegen V592 in nicht sterilem Boden. (b) Krankheitsgradanalyse des Welkens von Verticillium in [(a)] bei 40 dps. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die Krankheitsgrade wurden für jedes Inokulum aus 12 Töpfen mit insgesamt 48 Pflanzen bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 12 Topfpflanzen dargestellt.

Quelldaten

(a) Schematische Beschreibung zur Generierung des Pmt2iFo-Konstrukts. (b) Nachweis von Th-Pmt2i-Transformanten durch Southern Blot. Genomische DNA wurde wie angegeben durch die Restriktionsenzyme verdaut. Als Sonde diente die Promotorsequenz. Restriktionsenzymstellen sind im schematischen Diagramm gekennzeichnet. (c) Th-Pmt2iFo-Stämme zeigten eine normale Kolonie- und Hyphenmorphologie ähnlich wie Th. Maßstabsbalken: 10 μm. Die Experimente in (b) und (c) wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

In dieser Studie verwendete Primer.

Unverarbeitete Gele.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wen, HG., Zhao, JH., Zhang, BS. et al. Die durch Mikroben verursachte Gen-Stummschaltung erhöht den Pflanzenschutz vor bodenbürtigen Pilzpathogenen. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01507-9

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Eingegangen: 12. Dezember 2022

Angenommen: 02. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01507-9

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